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1、枸杞多糖誘導人食管癌細胞Eca：單鐵英，孫健，王芳，袁征，王曉華，楊書良【摘要】目的研究枸杞多糖誘導人食管癌細胞Eca-109凋亡作用及其作用機制。方法利用MTT染色在普通光鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化并觀測枸杞多糖對腫瘤細胞的抑制率;通過流式細胞儀分析人食管癌細胞Eca-109凋亡率、細胞周期變化;DNA瓊脂糖凝膠電泳方法檢測腫瘤細胞凋亡的DNA水平變化;激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。結(jié)果經(jīng)枸杞多糖作用后的人食管癌細胞Eca-109出現(xiàn)核固縮、凋亡小體、新月狀濃染區(qū)等細胞凋亡形態(tài)學改變,各劑量LBP組的腫瘤細胞均表現(xiàn)生長抑制,且具有劑量依
2、賴性,1000μg/mlLBP處理組的抑制率達96.02%。DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型的梯形電泳條帶。藥物處理組的腫瘤細胞更多地被阻止于G2/M期,各劑量組均出現(xiàn)明顯的凋亡變化,最大凋亡率可達21.3%。各劑量藥物處理組的腫瘤細胞內(nèi)的Ca2+濃度明顯高于對照組(P<0.01)。結(jié)論枸杞多糖可明顯抑制人食管癌細胞Eca-109的生長增殖,誘導細胞凋亡,并能改變該腫瘤細胞周期分布,阻止細胞周期于G2/M期?！娟P(guān)鍵詞】枸杞多糖;人食管癌細胞Eca-109;細胞凋亡 枸杞多糖(Lyciumbararumpolysaccharides,LBPs)是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要
3、成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成。近年來,對枸杞多糖的藥理作用進行了廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)枸杞多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤等功能[1～3],枸杞多糖的研究已成為當前的熱門課題。我們對枸杞多糖誘導人食管癌細胞Eca-109凋亡進行了系統(tǒng)研究,現(xiàn)報道如下?！ ?材料與方法 1.1材料人食管癌細胞株Eca-109,由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心引入,后經(jīng)我校中心實驗室傳代。枸杞多糖由本校實驗中心從寧夏優(yōu)質(zhì)枸杞子中分離提取，純度超過99%。 1.2細胞培養(yǎng)將人食管癌細胞株Eca-109置于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清和青霉
4、素、鏈霉素各100U/ml),在37℃,飽和濕度,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期后,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,收集,調(diào)配成相應的細胞濃度?！ ?.3MTT試驗制備成1×104/ml的Eca-109細胞懸液,吹打均勻后加入96孔板中,培養(yǎng)4h后,實驗組分4個劑量組,分別加入不同濃度的枸杞多糖(1000，800，400，200μg/ml),對照組加入培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h。 1.4流式細胞儀分析取實驗組和對照組細胞樣品,1000r/min離心10min,收集細胞,PBS洗滌2次,配成1×106/m
5、l細胞懸液,75%冷乙醇(-20℃)固定24h,上機測定前,離心去乙醇,用PBS洗滌2次,加入不含Dnase的RNA酶及EB染液,室溫反應30min,上流式細胞儀測定細胞凋亡?！ ?.5DNA瓊脂糖凝膠電泳分析取800μg/mlLBP處理組細胞,以冷PBS洗滌細胞,加裂解液600μl,混勻后加入10%SDS和蛋白酶K,55℃水浴3h,冷卻后加等體積Tris-HCl飽和酚和氯仿-異戊醇(24∶1)提取細胞DNA。吸取上清液加等體積無水乙醇和1/10體積NaAc沉淀DNA,用70%乙醇去殘留的有機物,用去離子水溶解DNA,取DNA與溴酚藍混勻,在1.5%瓊脂糖凝膠中,8
6、0V電壓下電泳30min?！ ?.6激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度取實驗組和對照組細胞樣品,分別1000r/min離心10min,收集細胞,PBS洗滌3次,離心,倒掉上清液,加入50μlFluo-3/AM(10μmol/L),吹打均勻,在37℃恒溫下負載60min,用D-Hank’s洗3次,充分洗去未負載的熒光探針,用LSCM檢測?！ ?結(jié)果 2.1細胞凋亡形態(tài)學變化光鏡下,可見處理各劑量組有不同程度的凋亡特征。表現(xiàn)為細胞貼壁不好,細胞形態(tài)不規(guī)整,細胞核固縮,有的出現(xiàn)核碎裂,偶見凋亡小體;對照組細胞生長良好,細胞透明,形態(tài)飽滿,顆粒較少,細胞
7、核隱約可見,無細胞凋亡特征。 2.2MTT染色檢測枸杞多糖對Eca-109細胞的影響及抑制率MTT染色細胞在普通光鏡下,實驗組細胞形態(tài)不規(guī)則,體積縮小,形成的藍紫色結(jié)晶聚集在細胞邊緣,有的形成新月狀或邊界分明的顆粒塊狀濃染區(qū),部分細胞成空泡狀;對照組細胞結(jié)構(gòu)完整,胞漿連續(xù),形成的藍紫色結(jié)晶分布比較均勻。實驗組與對照組比較腫瘤細胞存活率顯著降低。結(jié)果見表1表1枸杞多糖不同濃度對Eca-109的抑制率 2.3流式細胞儀檢測枸杞多糖對Eca-109癌細胞凋亡的影響不同劑量的枸杞多糖對Eca-109癌細胞有顯著的促進細胞凋亡作用,呈劑量依賴關(guān)系。在DNA直方圖的G1
