枸杞多糖對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用及與rb蛋白表達(dá)的關(guān)系

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1、枸杞多糖對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用及與Rb蛋白表達(dá)的關(guān)系：?jiǎn)舞F英，劉宇寧，楊書良【摘要】　　目的分析中藥枸杞多糖(LBP)對(duì)食管癌細(xì)胞株TE13的生長(zhǎng)抑制作用,探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯與Rb蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌細(xì)胞TE13,接種于96孔培養(yǎng)板,分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組各孔加入不同濃度的LBP,陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照孔加入化療藥物羥甲基喜樹堿,應(yīng)用MTT法檢測(cè)LBP對(duì)TE13細(xì)胞的抑制作用;光鏡下觀察TE13細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;免疫組化法檢測(cè)TE13細(xì)

2、胞經(jīng)藥物處理前后去磷酸化Rb蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果LBP對(duì)TE13細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用(P<0.01),其藥物濃度越大,作用時(shí)間越長(zhǎng),抑制效應(yīng)越強(qiáng);LBP作用48h時(shí),對(duì)TE13細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.61μg/ml。出現(xiàn)亞二倍體和凋亡峰(Ap);LBP能提高TE13細(xì)胞中Rb蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論LBP能顯著抑制TE13細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,其作用機(jī)制可能與CPP提高Rb蛋白的表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】枸杞多糖;食管癌;Rb蛋白　　枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides

3、,LBP)是枸杞子的提取物,具有多種生物活性作用［1］及抗腫瘤功能［2］,并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制其增殖［3］。我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū),河北省的涉縣和磁縣等地是食管癌集中高發(fā)區(qū),發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì)。LBP誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株TE13的凋亡及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本文旨在探討(LBP)對(duì)食管癌細(xì)胞株TE13凋亡的影響及其可能機(jī)制，為食管癌的防治提供新的途徑及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。　　1材料與方法　　1.1材料人食管癌細(xì)胞株TE13由本室提供。枸杞多糖由本校實(shí)驗(yàn)中心從寧夏優(yōu)質(zhì)枸杞子中分離提取，純度超過99%。PI染料、MTT試劑盒、SDS購(gòu)自美國(guó)Si

4、gma公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI1640和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。兔抗人去磷酸化Rb單克隆抗體和山羊抗兔第二抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?！　?.2細(xì)胞培養(yǎng)TE13細(xì)胞以含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。　　1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE13細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100μl(含1×104個(gè)細(xì)胞)。分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)

5、組各孔加入不同濃度的LBP各10μl,使其終濃度分別為1000，800，400，200，100μg/ml;陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基;陽(yáng)性對(duì)照孔加入化療藥物羥甲基喜樹堿(hydroxymethyl-camptothecin,HCPT)10μl,終濃度為10μg/ml;每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72h后,各孔加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)上清,每孔加入DMSO150μl,混勻后以波長(zhǎng)492nm,參考波長(zhǎng)620nm檢測(cè)各孔光密度(OD)值,按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50:細(xì)

6、胞生長(zhǎng)抑制率(CI,%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。　　1.4光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)LBP處理TE13細(xì)胞48h后,倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化?！　?.5流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率分別以800，400，200μg/ml的LBP作用于TE13細(xì)胞48h,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的70%乙醇固定12h;離心棄固定液,PBS重懸5min后300目篩網(wǎng)過濾;加入PI染液,4℃避光染色30min,流式細(xì)胞儀(Beckman)分析細(xì)胞周期及凋亡率?！　?.6細(xì)胞Rb蛋白表達(dá)的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE13細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為

7、2×105/ml,接種于6孔培養(yǎng)板,每孔細(xì)胞懸液1ml(含2×105個(gè)細(xì)胞),實(shí)驗(yàn)組各孔加入不同濃度的LBP各2ml,使其終濃度分別為21μg/ml;陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞,離心,常規(guī)細(xì)胞甩片,免疫細(xì)胞化學(xué)染色,采用SP法。在光學(xué)顯微鏡下觀察,以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆?；虬ぷ攸S色染色作為陽(yáng)性細(xì)胞,在低倍鏡下找到陽(yáng)性細(xì)胞較為密集的區(qū)域,取連續(xù)4個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)Rb陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù),取平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率?！　?.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用±s表示,采用單因素方差分析和兩樣本t檢驗(yàn);兩變量采用spearman線性相關(guān)分析?！　?結(jié)果　

8、　2.1LBP對(duì)TE13細(xì)胞增殖的抑制作用LBP對(duì)TE13細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用(P<0.01),并呈明顯時(shí)間和濃度依賴性。隨著LBP濃度的增加和作用時(shí)間的