肺癌外周血中egfr mrna、sp

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1、肺癌外周血中EGFRmRNA、SP:仲崇俊,蔣庚西,陶國華,王永旺【摘要】目的:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肺癌患者腫瘤組織和外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表達(dá),探討其作為肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)分子標(biāo)志物的可行性。方法:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)40例非小細(xì)胞肺癌組織和15例肺良性病變組織中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表達(dá);檢測(cè)40例肺癌患者外周血中靶基因的表達(dá),并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作為對(duì)照。結(jié)果:40例肺癌患者病理組織中EGFRmRNA、SP-DmRNA

2、、LUNXmRNA的表達(dá)率為77.5%(31/40)、100%(40/40)、100%(40/40),外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表達(dá)陽性率分別為55.0%(22/40)、52.5%(21/40)和57.5%(23/40);對(duì)照組中15例肺良性病變患者病理組織中EGFRmRNA表達(dá)率為13.3%(2/15),無SP-DmRNA和LUNXmRNA表達(dá),15例肺良性病變患者和10名健康人的外周血中無EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表達(dá)。結(jié)論:EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA作為

3、檢測(cè)肺癌組織及肺癌外周血微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物具有良好的敏感度和特異性;三者表達(dá)與肺癌TNM分期、組織學(xué)類型和癌細(xì)胞分化程度關(guān)系密切?!娟P(guān)鍵詞】肺腫瘤;微轉(zhuǎn)移;表皮生長因子受體;肺表面活性蛋白D;肺特異性蛋白X 肺癌細(xì)胞在術(shù)前、術(shù)中脫離原發(fā)灶,以非常少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、血液、骨髓或遠(yuǎn)處器官中,常規(guī)臨床檢查難以發(fā)現(xiàn),此為腫瘤的微轉(zhuǎn)移。RT-PCR技術(shù)的發(fā)展,使檢測(cè)外周血中微量癌細(xì)胞成為可能。但目前在肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)中,缺少公認(rèn)的特異的分子標(biāo)記物[1]。本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)了40例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血中

4、EGFR、SP-D和LUNX的表達(dá),分析其與病理生理學(xué)特征的關(guān)系,以探討靶基因作為診斷肺癌微轉(zhuǎn)移的價(jià)值?! ?材料和方法  1.1一般資料病例40例NSCLC患者均于本院胸心外科手術(shù)患者,病理學(xué)診斷明確,且臨床影像學(xué)檢查未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中,≥55歲31例,<55歲9例,男30例,女10例,腺癌22例,鱗癌18例;另選15例肺部良性疾病患者(包括良性腫瘤、肺大泡、支氣管擴(kuò)張等)及10名健康人作為對(duì)照組。  1.2試劑與引物設(shè)計(jì)參照GenBank,采用PrimerPremier5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)EGFR、SP-D和LUNX基因內(nèi)外引物,EGFR上游

5、:5'-CATCTCCGAAAGCCAACA-3',EGFR下游:5'-CGACGGTCCTCCAAGTAG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度244bp;SPD上游:5'-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3',SPD下游:5'-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度178bp;LUNX上游:5'-GGGCATTCTGGAAAACCT-3',LUNX下游:5'-GGCGTATTCACTTGGAGC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度237bp;內(nèi)參引物為GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)以檢測(cè)RNA的完整性,GAPDH上游:5’-CGGAGTCAACG

6、GATTGGTCGTAT-3',GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度306bp,由上海生工合成?! ?.3標(biāo)本的收集與總RNA抽提對(duì)所有肺癌患者于治療前抽取新鮮肝素抗凝血5ml,用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行有核細(xì)胞的分離,Trizol試劑一步法抽提總RNA,另對(duì)手術(shù)切除腫瘤于手術(shù)室內(nèi)切取小塊新鮮腫瘤組織液氮速凍保存,取約50~100mg行總RNA的抽提?! ?.4RNA鑒定對(duì)所抽提的總RNA行紫外分光光度定量,并行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。cDNA第一鏈合成取樣品總RNA約2μg加入20μl反應(yīng)體系中,按照

7、試劑盒提供的條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄?! CR擴(kuò)增EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA與GAPDH(內(nèi)參)。按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[4~6],結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行。具體反應(yīng)條件分列如下:EGFR、SP-D、LUNXPCR反應(yīng)體系25μl,其中cDNA2μl,10×PCRbuffer2.5μl,TaqDNA5U/μl聚合酶0.2μl,2mmol/LdNTPmix2.5μl,20mmol/LMgCl21.5μl,EGFR上、下游引物(10pm/L)各1μl,加入適量的雙蒸水,使總體積達(dá)25μl。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min,95°C變性45s

8、,50°C45s,72°C45s,共45個(gè)循環(huán),在第15個(gè)循環(huán)末時(shí)加入GAPDH上、下游引物(10pmol/L)各1μl,最后72°C延伸7min。P

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