曲美他嗪對(duì)糖尿病心肌病變大鼠mmp

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1、曲美他嗪對(duì)糖尿病心肌病變大鼠MMP【摘要】目的探討曲美他嗪對(duì)糖尿病(DM)大鼠心肌纖維化的影響。方法SD大鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（NC），糖尿病心肌病組(DCM)，曲美他嗪治療組(QMTQ)。免疫組化法、MP)-9及組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-l蛋白表達(dá)及含量。結(jié)果與NC組相比，DCM組中MMP-9、TIMP-1及TGF-β1蛋白表達(dá)及含量均明顯升高．MMP-9／TIMP-l比值降低。QMTQ組上述異常均明顯減輕。結(jié)論MMP-9、TIMP-l及TGF-β1三者平衡失調(diào)可能是使DM心肌纖維化發(fā)生的機(jī)制之一，曲美他嗪可能是通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)

2、，升高M(jìn)MP-9/TIMP-1比值，保持心肌間質(zhì)膠原合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡，而抑制糖尿病心肌纖維化的發(fā)生。【關(guān)鍵詞】曲美他嗪；糖尿病心肌纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶DCM作為DM的一種獨(dú)特的心臟并發(fā)癥已得到公認(rèn)，其主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大、凋亡和心臟間質(zhì)纖維化(MF)，其纖維化的發(fā)生機(jī)制不完全清楚。基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（MMPS/TIMPS）共同構(gòu)成體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的最重要的系統(tǒng)，參與了多種原因所致的心臟間質(zhì)纖維化過(guò)程[1]。曲美他嗪作為改善心肌細(xì)胞能量代謝藥物已在臨床中已廣泛應(yīng)用，但其對(duì)糖尿病心肌纖維化的研究報(bào)道較少。本

3、試驗(yàn)予曲美他嗪對(duì)DM大鼠MF的影響，探討MMP-9/TIMP-1及TGF-β1在DCM發(fā)生過(guò)程中的作用，為臨床DCM的治療提供參考。1對(duì)象和方法1.1對(duì)象選2月齡健康雄性SD大鼠（180～200g）50只（由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；鏈脲佐菌素（STZ）（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）；曲美他嗪（武漢福達(dá)醫(yī)藥化工有限公司）；MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易公司)；TUNEL試劑盒（購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；P53、Bax、Bcl-2兔抗小鼠單克隆抗體（購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司）。1.2模型與分組健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分出10只作為

4、正常對(duì)照組（NC），其余以45mg·Kg-1一次性尾靜脈注射1%STZ溶液，正常對(duì)照組注入等量容積上述緩沖液。注射后72h采尾靜脈血測(cè)血糖，血糖濃度大于16.7mmol·L-1者為糖尿病大鼠模型。糖尿病模型形成后，普通飼料喂食6周，隨機(jī)抽取大鼠10只，取心肌組織觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)，糖尿病心肌病變模型形成標(biāo)準(zhǔn)為：心肌肌原纖維排列紊亂，局部斷裂明顯，肌絲成分減少，間質(zhì)膠原纖維增生；心肌內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，核染色質(zhì)邊集，基底膜出現(xiàn)不規(guī)則明顯增厚，微血管瘤形成；線粒體腫脹變形、嵴稀疏，排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清。按隨機(jī)數(shù)字表方法將糖尿病大鼠隨機(jī)分為兩組：糖尿病心肌病組(D

5、CM)，曲美他嗪(QMTQ)治療組。最終用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物為對(duì)照組10只，模型組10只，治療組10只。糖尿病大鼠心肌病變模型制備成功后開(kāi)始給藥，持續(xù)6周。治療組給予曲美他嗪10mg·kg-1，每天灌胃一次，給藥容量為10ml·Kg-1，NC組和DCM組給予等容量純凈水。1.3指標(biāo)測(cè)定1.3.1免疫組化檢測(cè)測(cè)定MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平石蠟切片放入恒溫水浴槽烤片2h，常規(guī)酒精從低到高濃度脫蠟至水，置入3%H2O2中滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。將切片浸入含0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋內(nèi)，蓋上壓力閥至噴氣后持續(xù)2～3min抗原修復(fù)

6、，自然冷卻后PBS（pH7.2～7.6）洗滌。滴加5%BSA封閉液，室溫20min，滴加1:100稀釋MMP-9、TIMP-1、TGF-β1兔抗鼠單抗，4℃過(guò)夜。PBS洗滌后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫20min，PBS洗2min×3次。滴加SP復(fù)合物，室溫20min，PBS洗2min×4次。DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，逐級(jí)酒精脫水，透明，封片。光鏡下觀察攝片，每張切片于左上、左下、右上、右下及中部隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×400）測(cè)量灰度值，將每張切片平均灰度值作為該切片的灰度值。1.3.2MP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白含量心肌組織

7、勻漿取上清液，提取蛋白樣品，按秩序加入泳道進(jìn)行SDS．PAGE，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，堿性磷酸酶顯色。檢測(cè)免疫復(fù)合物，利用凝膠自動(dòng)分析軟件，以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析得出數(shù)據(jù)文件。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠的一般情況實(shí)驗(yàn)期間NC組大鼠精神狀況良好，反應(yīng)靈敏；DCM組大鼠明顯消瘦，精神萎靡，因感染或糖尿病加重死亡5只；治療組因麻醉過(guò)重死亡3只，

8、治療期間死亡2只，與DCM組相比，精神狀態(tài)尚可，無(wú)失明發(fā)生。DCM