大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

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1、大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)[1/3]【摘要】目的探討大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)方法。方法體外原代培養(yǎng)新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法及電子顯微鏡鑒定神經(jīng)元。結(jié)果用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal-A)+B27培養(yǎng)的神經(jīng)元純度可達(dá)85%,生長狀態(tài)較佳。結(jié)論以Neurobasal-A+B27培養(yǎng)的大藏大腦皮質(zhì)神經(jīng)元活性較佳，純度較高，是體外研究神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)理論的良好模型?！娟P(guān)鍵詞】大腦皮質(zhì)；神經(jīng)元；疾病模型，動(dòng)物；細(xì)胞，培養(yǎng)的ABSTRACT:ObjectiveToestablishaprimaryculturemet

2、hodoftheratcorticalneurons.MethodsPrimarycultureofcorticalneuronswasmadefromnewbornrats.Immunocytochemicalandelectronicmicoscopicmethodswereusedtoidentifytheculturedneurons.ResultsTheprimarycorticalneuronsculturedwithneurobasal-A/B27grewquitewellandthepuritywasabout85%.ConclusionT

3、heprimarycorticalneuronsculturedwithneurobasal-A/B27mediumareactiveandratherpureandcouldbeagoodmodelforresearchofthenervoussystem.KEYWORDS:cerebralcortex;neurous:diseasemodels,animal:ce11s,cultured:nuride中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種疾病如缺氧缺血性腦病、中風(fēng)等對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元均有不同程度的損傷，為研宄其具體的作用機(jī)理及防治措施，建立合適的體內(nèi)外模型至關(guān)重要。神經(jīng)元原

4、代培養(yǎng)是研宄神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及缺氧、缺血、中毒、外傷等病理因素影響的重要方法之一，為進(jìn)一步的研究提供良好的原代神經(jīng)元生物學(xué)材料，筆者探討大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)［1/3］方法。1材料與方法試劑和動(dòng)物神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Neurobasal-A）、胎牛血清（FBS）、B27（美國Gibco公司），左旋多聚賴氨酸（PLL，美國Sigma公司），DF_12（美國Hyclone公司），胰蛋白酶（美國Amerisco公司），NSE（Neuron-Specificenolase，神經(jīng)元特異性烯醇化酶）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），U1traVision二抗

5、試劑盒（美國Neomarker公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純。新生健康SD大鼠（大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（閩）2004-002］。皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)培養(yǎng)方法按參考文獻(xiàn)［1-3］改進(jìn)后進(jìn)行。大鼠3只，75%冷乙醇浸泡35min,無菌條件下斷頭殺死，取出大腦，放入預(yù)冷的D-PBS平衡鹽液中。在解剖鏡下仔細(xì)分離去除腦膜及血管，分離出大腦皮質(zhì)并剪碎成約ImmXImmXlmm大小組織塊以%胰蛋白酶消化,并用含10%FBS的DF12完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以1X106mL-1密度接種在經(jīng)PLL處理過的培養(yǎng)瓶，于37V、相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

6、細(xì)胞培養(yǎng)4h后，將種植液（含10%FBS的DF12）全量換成含2%B27的Neurobasal-A培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，以后每隔3d以Neurobasal-A/B27半量換液。培養(yǎng)瓶包被方法:用mg/mL的PLL37'C包被lh，PBS洗2遍，直接接種。將培養(yǎng)不同時(shí)間的神經(jīng)元于LEITZ倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，注意神經(jīng)元的生長狀況免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定神經(jīng)元培養(yǎng)4d，棄去培養(yǎng)液;冷4%多聚甲醛固定20min;3%H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;封閉后滴加一抗NSE多克隆抗體（1:200），4°C過夜；加二抗（生物素標(biāo)記羊抗免IgG），室溫孵育30min;DAB顯色；中性樹

7、膠封固，鏡下觀察。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用mol/LPBS代替一抗，其余步驟同上。鏡下隨機(jī)選取30個(gè)視野，計(jì)數(shù)NSE陽性神經(jīng)元的百分率。電子顯微鏡觀察用玻璃瓶常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至4d時(shí)，以胰蛋白酶消化分離并收集細(xì)胞，迅速投入3%戊二醛+%多聚甲醛混合電鏡固定液中，經(jīng)1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，透射電鏡下觀察，注意神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。2結(jié)果細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化培養(yǎng)4h細(xì)胞基本貼壁，呈圓形透亮，體積小，立體感強(qiáng)，偶見少數(shù)細(xì)胞伸出細(xì)小短突起。培養(yǎng)ld，大部分細(xì)胞長出突起，長度約為胞體直徑的12倍，偶見相鄰?fù)黄鹣噙B接;胞體圓形或橢圓形，飽滿，光暈明顯（圖1A）。

8、培養(yǎng)2d，細(xì)胞數(shù)目增多，突起增長（圖1B）。培養(yǎng)3d，胞體明顯增大