大鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng)

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1、大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,無菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀將胰腺剪成1ｍｍ3大小的組織塊,加入0.5ｇ·Ｌ-1膠原酶,37℃恒溫水浴振蕩消化15ｍｉｎ,將已消化至細(xì)顆粒狀組織吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液終止消化,余下未消化完全的組織加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口徑吸管輕輕吹打,直至大部分組織被消化成細(xì)顆粒狀,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液終止消化?；旌锨昂髢刹糠值南a(chǎn)物,用Ｈａｎｋｓ液低速離心洗滌3次后,將組織置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1鏈霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ

2、·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培養(yǎng)液中,用150目(108μｍ)尼龍篩網(wǎng)過濾,以除去未被消化的組織和結(jié)締組織。將已分離好的胰島細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán),置于含上述培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。24ｈ后,吸出未貼壁的細(xì)胞懸液,低速離心以收集細(xì)胞,顯微鏡下計數(shù)后,以每孔一定數(shù)量胰島細(xì)胞團(tuán)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)48ｈ后用于實驗。我分離胰島細(xì)胞后,用DTZ染色,發(fā)現(xiàn)溶液中含有許多小顆粒,放入溫箱中也未發(fā)生變化,鏡下觀察沒有看到文獻(xiàn)中所說的紅染細(xì)胞。我是將100mg雙硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用濾紙過濾，用時用KRB

3、B緩沖液稀釋100倍。胰島細(xì)胞分離是將成年大鼠胰腺用膠原Ⅴ酶消化后，過150目網(wǎng)取濾過液，再過400目網(wǎng)取網(wǎng)上細(xì)胞，加入L-DMEM培養(yǎng)。方法是我根據(jù)文獻(xiàn)稍作改動后實施的。胰島細(xì)胞分離和染色對于我都是第一次做，請高手指點一下。溶液中如果有紫黑色小顆粒，那就是DTZ，過濾除的不凈。沒有紅染的細(xì)胞就是沒有胰島啊。還有，我總覺得150目太密了，很多胰島都濾不過去吧大鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng)一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15分鐘，無菌取出胰臟，于冰冷無菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細(xì)清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉(zhuǎn)入青

4、霉素小瓶中，加入少量無菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細(xì)小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks液反復(fù)清洗8~10次，加入10倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025gⅤ型膠原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100mL無Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無菌D-Hanks液將組織塊清

5、洗2~3次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復(fù)上述步驟。此時組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進(jìn)行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細(xì)胞，重新用無菌D-Hanks懸浮，離心，重復(fù)1~2次，再用培養(yǎng)基洗2~3次，用培養(yǎng)基懸浮即得細(xì)胞懸液；將消化過的組織塊重復(fù)消化5~6次至組織塊消化完全，重復(fù)以上操作，合并幾次所得細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個細(xì)胞/mL，將細(xì)胞懸液接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1mL，置于37℃，5%C

6、O2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于成纖維細(xì)胞貼壁要比胰島細(xì)胞迅速，接種15小時后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細(xì)胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細(xì)胞。將新培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5小時，可除去絕大部分成纖維細(xì)胞，而胰島細(xì)胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細(xì)胞，胰島細(xì)胞移植的研究進(jìn)展人類至今已有100多年用移植方法治療糖尿病的歷史，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病存在兩個障礙：組織來源

7、不足和免疫排斥反應(yīng)。一．胰島細(xì)胞的來源1．同種的成人及胎兒胰島成人胰島一般取自新死亡的健康尸體，抗缺氧的能力較弱，且慢存在外分泌活性組織，死亡之后即迅速自溶，故應(yīng)用較為困難。而胎兒胰島對低溫缺氧的耐受能力較強、免疫原性弱、胰島組織豐富、含有干細(xì)胞、移植后可保持正常的生長增殖能力，因此成為較為理想的供體組織。2．異種胰島豬的組織來源廣泛，血糖調(diào)定點與人相似，豬胰島素與人胰島素排列極為接近，且能在新鮮的人血清組織中存活增生，豬胰島成為最有可能的異種供體。3．胰腺導(dǎo)管細(xì)胞胰腺導(dǎo)管細(xì)胞具有極強的擴增和分化能力，可在適宜的外部刺激下通過快速增

8、殖喪失其導(dǎo)管細(xì)胞表現(xiàn)型，從而還原成多潛能細(xì)胞并進(jìn)一步分化成為胰島細(xì)胞。4．干細(xì)胞根據(jù)來源分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。5．基因技術(shù)產(chǎn)生的具有胰島素代謝特征的新型細(xì)胞運用基因從組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將胰島素基因直接或間接轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，從而構(gòu)建