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1、西羅莫司對肝癌HepG2細(xì)胞中HIF【摘要】目的研究西羅莫司對氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)的影響。方法用CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞模擬缺氧微環(huán)境，并根據(jù)CoCl2濃度不同分為0、50、100、200及400μmol/L組；選擇CoCl2濃度為200μmol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，同時分別聯(lián)合0、10、20、30、40nmol/L的西羅莫司作用于細(xì)胞24h。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測HIF-1αmRNA的表達(dá)。結(jié)果隨CoCl2濃度提高，HIF-1αmRNA的表達(dá)升高（F=103.67,q=4.83～24.15,P
2、<0.05），其中CoCl2濃度為200和400μmol/L兩組比較差異無顯著性（q=0.69,P>0.05）；西羅莫司可使HepG2細(xì)胞HIF-1αmRNA的表達(dá)降低并呈劑量依賴性（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。結(jié)論缺氧微環(huán)境可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)，HIF-1α可能通過在細(xì)胞缺氧調(diào)控中起作用而參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。西羅莫司可以抑制HIF-1αmRNA的表達(dá)，這可能是其抗腫瘤的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】肝腫瘤；HepG2細(xì)胞；西羅莫司；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基 ［ABSTRACT］Objecti
3、veToinvestigatetheeffectofsirolimusontheexpressionofhypoxia-induciblefactor-1alpha（HIF-1α）inhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cellsinducedbycobaltchloride.MethodsCobaltchlorideimicthecellhypoxicmicroenvironment,andHepG2cellsol/Lgroups.Theconcentrationof200μmol/Lofcobaltchlorideimictumo
4、rhypoxicmicroenvironment,and,atthesametime,differentconcentrationsofsirolimus（0,10,20,30,and40nmol/L）RNAi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）.ResultsI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；SRL為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒購自Introvigen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promege公司；引物及GAPDH
5、內(nèi)參由上海生工生物工程公司提供?！ ?.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞由南京凱基生物科技有限公司提供。將肝癌HepG2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清的1640培養(yǎng)基,內(nèi)含100U/L青鏈霉素，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、正常氧濃度與飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)入對數(shù)生長期后，傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，選擇生長良好的肝癌細(xì)胞用于實驗?！ ?.2.2實驗分組 對照組用培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，實驗組用培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，用含不同濃度CoCl2的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24h，根據(jù)CoCl2濃度不同分為5個亞組（0、50、100、200和400μm
6、ol/L組）；選擇CoCl2濃度為200μmol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，用培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24h后，對照組用200μmol/L的CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，實驗組用含SRL分別為0、10、20、30、40nmol/L的200μmol/L的CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。 1.2.3RT-PCR TRIZOL法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA，紫外線分光光度計測定總RNA濃度，重復(fù)測定3次，-70℃冰箱保存。各樣本取1μg總RNA，按Promege一步法使用說明書進(jìn)行RT-PCR；所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成：HIF-1α上游引物序列為5′-ACGTGTT
7、ATCTGTCGCTTTG-3′,下游引物序列為5′-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′,目的片段長度為371bp；內(nèi)參照基因GAPDH的上游引物序列為5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，目的片段長度為146bp。RT-PCR反應(yīng)條件：45℃逆轉(zhuǎn)錄45min，94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，64℃退火1min，68℃延伸2min，27次循環(huán)后68℃終末延伸7min。取出5μLPCR產(chǎn)物，加1μLLoadingbuffer，反復(fù)吸打混勻后，于20g/L的
8、瓊脂糖凝膠
