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《血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純和鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在應用文檔-天天文庫。
1、WORD文檔下載可編輯血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純與鑒定一、實驗目的1.掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋白質的原理和基本方法；2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法；3.了解柱層析技術。二、實驗原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實驗利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技術觀察蛋白質分離教果。1．鹽析蛋白質分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因為有兩個穩(wěn)定因素：表面的電荷和水化膜。當維持蛋白質的穩(wěn)定因素破壞時，蛋白質分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質分子沉淀析出的方法很多
2、，根據對蛋白質穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸銨((NH４)２SO4)等對蛋白質作用破壞了蛋白質表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白質相互聚集而析出。由于血清中各種蛋白質分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，因此調節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質沉淀從而達到分離的目的。血清球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而血清清蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀，利用此特性可把蛋白質分段沉淀下來，即在半飽和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，
3、離心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸餾水即可溶解，由此達到分離清蛋白和白蛋白的目的。2．脫鹽專業(yè)技術資料分享WORD文檔下載可編輯鹽析得到的蛋白質含有高濃度中性鹽，需要有脫鹽過程去除蛋白質遺留的中性鹽，常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實驗采用凝膠層析法脫鹽，在葡聚糖凝膠柱中，蛋白質與鹽的分子量不同，當樣品通過層析柱時，分子量較大的蛋白質因為不能通過網孔而進入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動，所以流程較短，向前移動速度較快，最先流出層析柱；反之，鹽的分子量較小，可通過網孔而進入凝膠顆粒，所以流程長，向前
4、移動速度較慢，流出層析柱的時間較后。分段收集蛋白質洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質。3.純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。本實驗采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負電荷的離子可與其進行交換結合，帶正電荷的點正電荷的離子則不能，這樣便可達到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點的不同可進行分離。血清中各種蛋白質的pI各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質所帶的電荷
5、不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和伽馬球蛋白分離出來。4.純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血漿中各種蛋白質分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。三、材料與方法：以流程圖示意1.實驗材料人血清、葡聚糖凝膠G-25(Sephadex專業(yè)技術資料分享WORD文檔下載可編輯G
6、-25)層析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱、飽和硫酸銨溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.06mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.02mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、電泳儀、電泳槽。2.實驗方法1)實驗流程純化鑒定脫鹽粗提DEAE纖維素離子交換層析醋酸纖維素薄膜電泳葡聚糖凝膠層析鹽析法進行粗分離2)實驗步驟① 鹽析：中性鹽沉淀步驟步驟操作（1）鹽析取離心管一個，加入0.8mol人或動
7、物血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻后室溫下放置10min，離心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用（2）溶解沉淀向離心管的沉淀加入0.6mol蒸餾水，振搖使之溶解，作為純化γ球蛋白用注意：上層清夜盡量全部吸出，但不可吸出沉淀物。② 脫鹽：過凝膠層析柱步驟專業(yè)技術資料分享WORD文檔下載可編輯步驟操作（1）調節(jié)層析柱液面葡萄糖凝膠G-25層析柱經0.02mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓儲液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層析柱上的緩
8、沖液面剛好下降到凝膠床液面（2）加樣品用細長滴管吸取上述經鹽析所得的粗制蛋白質溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱下端用10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋夾，調節(jié)適當流速，使樣品進入凝膠床，至液面降到凝膠床表面為止（3）洗層析柱小心用0.02mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液洗滌層析柱內壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋
