血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純和鑒定

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1、word資料下載可編輯血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法；2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法；3.了解柱層析技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實(shí)驗(yàn)利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技術(shù)觀察蛋白質(zhì)分離教果。1．鹽析蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素：表面的電荷和水化膜。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質(zhì)

2、分子沉淀析出的方法很多，根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機(jī)溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸銨((NH４)２SO4)等對(duì)蛋白質(zhì)作用破壞了蛋白質(zhì)表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白質(zhì)相互聚集而析出。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，因此調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。血清球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而血清清蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀，利用此特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來，即在

3、半飽和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，離心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸餾水即可溶解，由此達(dá)到分離清蛋白和白蛋白的目的。2．脫鹽專業(yè)技術(shù)資料word資料下載可編輯鹽析得到的蛋白質(zhì)含有高濃度中性鹽，需要有脫鹽過程去除蛋白質(zhì)遺留的中性鹽，常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法脫鹽，在葡聚糖凝膠柱中，蛋白質(zhì)與鹽的分子量不同，當(dāng)樣品通過層析柱時(shí)，分子量較大的蛋白質(zhì)因?yàn)椴荒芡ㄟ^網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動(dòng)，所以流程較短，向前移動(dòng)速度較快，最先流出層析柱；反

4、之，鹽的分子量較小，可通過網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程長，向前移動(dòng)速度較慢，流出層析柱的時(shí)間較后。分段收集蛋白質(zhì)洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質(zhì)。3.純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的點(diǎn)正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點(diǎn)的不同可進(jìn)行

5、分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pI各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和伽馬球蛋白分離出來。4.純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于血漿中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。三、材料與方法：以

6、流程圖示意1.實(shí)驗(yàn)材料人血清、葡聚糖凝膠G-25(Sephadex專業(yè)技術(shù)資料word資料下載可編輯G-25)層析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱、飽和硫酸銨溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.06mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.02mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、電泳儀、電泳槽。2.實(shí)驗(yàn)方法1)實(shí)驗(yàn)流程純化鑒定脫鹽粗提DEAE纖維素離子交換層析醋酸纖維素薄膜

7、電泳葡聚糖凝膠層析鹽析法進(jìn)行粗分離2)實(shí)驗(yàn)步驟①　鹽析：中性鹽沉淀步驟步驟操作（1）鹽析取離心管一個(gè)，加入0.8mol人或動(dòng)物血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻后室溫下放置10min，離心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用（2）溶解沉淀向離心管的沉淀加入0.6mol蒸餾水，振搖使之溶解，作為純化γ球蛋白用注意：上層清夜盡量全部吸出，但不可吸出沉淀物。②　脫鹽：過凝膠層析柱步驟專業(yè)技術(shù)資料word資料下載可編輯步驟操作（1）調(diào)節(jié)層析柱液

8、面葡萄糖凝膠G-25層析柱經(jīng)0.02mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓儲(chǔ)液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層析柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床液面（2）加樣品用細(xì)長滴管吸取上述經(jīng)鹽析所得的粗制蛋白質(zhì)溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱下端用10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋夾，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速，使樣品進(jìn)入凝膠床，至液面降到凝膠床表面為止（3）洗層析柱小心用0.02mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液洗滌層析柱內(nèi)壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液（