流感嗜血桿菌保存方法比較

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1、流感嗜血桿菌保存方法比較　　1材料與方法　　1.1菌種及標(biāo)本臨床菌株為河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科門(mén)診及幼兒園正常兒童咽部的分離株,共32株,均通過(guò)衛(wèi)星現(xiàn)象鑒定為流感嗜血桿菌?！　?.2方法　　1.2.1甘油血清肉湯法甘油肉湯按照1∶1混勻后121.3℃15min，冷卻后無(wú)菌加入10%血清混勻,取0.5mL分裝于1mLeppendorf中，放于支架上合蓋但勿蓋嚴(yán)，挑取巧克力平板上生長(zhǎng)旺盛的流感嗜血桿菌數(shù)個(gè)菌落研磨于此培養(yǎng)基中，4℃冰箱穩(wěn)定1h之后，放入-20℃保存?！　?.2.2脫脂牛乳法[1]買(mǎi)來(lái)新鮮牛乳煮沸5次，完全脫脂后取0.5mL分裝于1mLeppendorf中，放于支架上合蓋

2、但勿蓋嚴(yán)115.6℃15min。挑取流感嗜血桿菌數(shù)個(gè)菌落研磨于此培養(yǎng)基中，4℃冰箱穩(wěn)定1h之后，放入-20℃保存?！　?.2.3紙片法[2]保存菌種濾紙片購(gòu)自O(shè)XOID公司的Ⅴ+Ⅹ因子無(wú)菌紙片;保存菌種玻璃瓶：臨床青霉素玻璃小瓶用濃度10%的84消毒液浸泡12h，用洗潔精洗滌后，用清水沖洗5次，最后用蒸餾水沖洗10次，溫箱烘干后高壓滅菌備用。用無(wú)菌小鑷子夾?、?Ⅹ因子濾紙片，用無(wú)菌接種環(huán)挑取流感嗜血桿菌涂劃于其上，小心放入菌種保存玻璃瓶?jī)?nèi)，每瓶一片并做標(biāo)記。將裝有菌片的玻璃瓶放置在-20℃塑封保存?！　?.2.4真空冷凍干燥法[3]冷凍干燥箱、干燥機(jī)等。流感嗜血桿菌純培養(yǎng)物接種于37g

3、/L牛心浸液+0.03%氯化血紅素+0.01%輔酶Ⅰ中培養(yǎng)36h后，用無(wú)菌毛細(xì)管吸取菌液放到eppendorf中，于-20℃冰箱穩(wěn)定1h，然后放置到冷凍干燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干，抽真空后4℃冰箱保存。　　1.3復(fù)蘇鑒定　　分別在上述菌種保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年的不同時(shí)期，取出進(jìn)行復(fù)蘇鑒定。甘油血清肉湯法和脫脂牛乳法保存的菌種，從冰箱取出溶解后直接傾注于巧克力平板上;紙片法和真空冷凍干燥法保存的菌種，取出后放入0.5mL無(wú)菌鹽水中，充分振搖混勻后，放入35℃的中孵育30min，然后分別將菌液傾注于巧克力色平板，放入燭缸，35℃培養(yǎng)24～48h，觀察各菌株存活情況，并轉(zhuǎn)種血平板進(jìn)行衛(wèi)星現(xiàn)

4、象鑒定，排除污染的可能性?！　?.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)分析?！　?.3甘油血清肉湯法與脫脂牛奶保存法及真空冷凍干燥法在相同時(shí)間段存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中1個(gè)月存活率比較P<0.01;而3個(gè)月、6個(gè)月、1年存活率比較P<0.001?！　?.4紙片法與脫脂牛奶保存法及真空冷凍干燥法在相同時(shí)間段存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表132株流感嗜血桿菌不同保存方法存活率對(duì)比(%)　　保存方法1個(gè)月存活率3個(gè)月存活率6個(gè)月存活率1年存活率甘油血清肉湯法43.9(7/32)21.9(7/32)18.8(6/32)6.3(2/32)脫脂牛乳法

5、93.8(30/32)87.5(28/32)87.5(28/32)53.1(17/32)紙片法6.3(2/32)6.3(2/32)3.1(1/32)0真空冷凍干燥法96.9(31/32)96.9(31/32)93.8(30/32)93.8(30/32)　　3討論　　由于流感嗜血桿菌生存能力較差，需及時(shí)轉(zhuǎn)種及保存，即使在4℃冰箱內(nèi)一旦菌種放置時(shí)間超過(guò)3d，再次轉(zhuǎn)種也不易獲得成功[4]。通過(guò)反復(fù)探究我們總結(jié)出以上四種主要的保存方法，從其復(fù)蘇后存活率對(duì)比來(lái)看，用真空冷凍干燥法流感嗜血桿菌平均存活率為93.8%～96.9%,此法是先將細(xì)菌在低溫中迅速冷凍，然后在高真空狀態(tài)下迅速脫水干燥，真空密

6、封而成。雖然效果最好，但此法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需價(jià)格昂貴的冷凍真空干燥箱和真空泵等設(shè)備故成本較高，給實(shí)際工作帶來(lái)諸多不便[5]。甘油血清肉湯法利用甘油作為脫水劑的原理，在臨床中應(yīng)用較多，而且簡(jiǎn)單方便保存一般菌種效果也非常好，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此方法不宜保存苛養(yǎng)菌，流感嗜血桿菌1個(gè)月存活率僅為43.9%，與真空冷凍干燥法相比差異有顯著性。而吳茂紅[1]提供的紙片方法雖然強(qiáng)調(diào)不可以保存苛養(yǎng)菌，但是我們根據(jù)理論上流感嗜血桿菌生長(zhǎng)需要的原理改良，采用OXOID公司的Ⅴ+Ⅹ因子無(wú)菌紙片作為載體，結(jié)果顯示此方法仍不適合保存苛養(yǎng)菌，與蔣金芬[2]報(bào)道一致。而脫脂牛乳法的牛奶未經(jīng)工業(yè)加工處理，營(yíng)養(yǎng)成

7、份基本上未丟失，無(wú)任何添加劑，有利于流感嗜血桿菌的代謝，-20℃冰箱保存，6個(gè)月、1年內(nèi)存活率分別為87.5%和53.1%,與真空冷凍干燥法比較,6個(gè)月內(nèi)存活率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，因而此法保存流感嗜血桿菌效果較好，基于其方法簡(jiǎn)單，在不超過(guò)半年內(nèi)，作為短期保存流感嗜血桿菌較為理想的保存法，具有較高的推廣價(jià)值，特別適用于從事流感嗜血桿菌研究的科研和教學(xué)單位。　　眾所周知，流感嗜血桿菌是一種營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻的細(xì)菌，營(yíng)養(yǎng)要求高，比較