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1、流式抗體及熒光染料的選擇陳曉東產(chǎn)品技術(shù)專員抗原抗體反應12流式抗體的選擇、熒光染料應用2珈源醫(yī)學抗原抗體反應抗原抗體反應的原理抗原抗體反應的特點影響抗原抗體反應的因素3珈源醫(yī)學抗原抗體反應:指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應?？乖c抗體的特異性結(jié)合既會在體內(nèi)發(fā)生，亦可以在體外進行，體外進行的抗原抗體反應習慣上稱作血清學反應抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體物質(zhì)基礎(chǔ)4珈源醫(yī)學抗原抗體反應的特點特異性可逆性比例性階段性5珈源醫(yī)學前帶(prez
2、one)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalencezone)：抗原抗體比例合適抗原抗體反應比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關(guān)系8珈源醫(yī)學階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應快，不可見第二階段：反應可見階段，反應慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象9珈源醫(yī)學影響抗原抗體反應的因素一、反應物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價二、環(huán)境因素電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9（pH7.2～pH7.4）溫度:15℃～40℃（4℃），3
3、7℃最適10珈源醫(yī)學流式抗體的選擇、熒光染料應用11珈源醫(yī)學RUOASRIVDⅡ類體外診斷試劑分析物特異性試劑僅用于研究12珈源醫(yī)學單克隆抗體混合單克隆抗體多克隆抗體熒光直標的抗體未標記的抗體（需要熒光標記的二抗進行間接標記檢測）單分子熒光素復合分子熒光素13珈源醫(yī)學信噪比（S/N）：特異性熒光信號（signal）與非特異性熒光信號的比值PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCPS/N越大，表明陽性與對照細胞的熒光峰分離越好，當S/N大于3時屬于可接受范圍14珈源醫(yī)學綜合因素：熒光標記效率：抗體
4、上標記熒光素的數(shù)量（E/P比值）也會影響相對熒光強度?？贵w檢測的抗原密度：高密度的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體檢測，而較低表達的抗原則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標記的抗體檢測，從而達到有效區(qū)分陽性細胞群和何陰性細胞群的目的。細胞自發(fā)熒光：檢測自發(fā)熒光水平高的細胞時，使用發(fā)射光波長較長的熒光染料（如APC）可以得到較好的S/N比值。15珈源醫(yī)學理想熒光素具有高的光子產(chǎn)量，信號強度高對激發(fā)光有較強的吸收，降低背景信號激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間距離較大，減少背景信號的干擾易與被標記的抗原、抗體或其他生物物質(zhì)結(jié)
5、合而不影響被標記物得特異性穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標本抗凝劑和固定劑的影響16珈源醫(yī)學17珈源醫(yī)學18珈源醫(yī)學根據(jù)儀器選用熒光素：1.每個通道只能選擇1種熒光素2.各個通道之間的熒光素可以隨意搭配搭配的熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小19珈源醫(yī)學注意：1.不要為了節(jié)省熒光抗體，未經(jīng)過預實驗就按抗體說明書減半量甚至更多進行標記。2.不能完全憑感覺進行標記，需進行細胞計數(shù)。3.應用FITC標記抗體時，避免使用酸性緩沖溶液，因為FITC的熒光特性是pH依賴的。4.熒光抗體、熒光染色的樣本應避免暴露于強光下。5.建議盡快上機檢測（最好
6、24h內(nèi)）。20珈源醫(yī)學ThankYou!陳曉東產(chǎn)品技術(shù)專員21珈源醫(yī)學
