菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程,操作規(guī)程.doc

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1、菌種管理制度1、目的建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標準操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗結(jié)果的準確可靠。2、適用范圍本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義?標準菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。?傳代用菌種是指用標準菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。?工作用菌種是指用標準菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。?菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)

2、基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4、職責(zé)4.1部門主管負責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2微生物檢驗員負責(zé)菌種的確認、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1菌種的申購部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計劃（包括臨時檢驗需要），填寫申購流程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標準菌株）或傳代用菌種，購買時，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2菌種的接收菌種到達實驗室后，由部門主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在《標準菌株庫存記錄》上，內(nèi)容

3、包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于4～8℃冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3菌種的保存5.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至4～8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時間根據(jù)菌種種類而1不同，細菌：每個月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞：3~6個月轉(zhuǎn)種一次；絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種一次。5.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存

4、法。5.3.2.1甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細菌充分擴散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30℃冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用時，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃

5、色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。5.3.2.2液體石蠟保存法5.3.2.2.1無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121℃滅菌30分鐘,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。5.3.2.2.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍或2～8℃冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌

6、等）。5.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）甘油冷凍管-30℃2年枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕液體石蠟管2-8℃1年黑曲霉菌〔CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏5.4.1標準菌株的復(fù)蘇、確認、傳代5.4.1.1標準菌株的復(fù)蘇25.4.1.1.1物品及試劑：

7、接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培養(yǎng)基?改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；?液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；?營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；?改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3標準菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b)用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。c)以無

8、菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體