菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程,操作規(guī)程

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1、專業(yè)技術(shù)資料分享菌種管理制度1、目的建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2、適用范圍本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義?標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。?傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。?工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后

2、，作為日常工作使用的菌種。?菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4、職責(zé)4.1部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1菌種的申購部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計(jì)劃（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要），填寫申購流程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或省（市）藥檢所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或傳代用菌種，購買時(shí)，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2菌種的接收菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，由部門主管

3、接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在《標(biāo)準(zhǔn)菌株庫存記錄》上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號(hào)（無編號(hào)者按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于4～8℃冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3菌種的保存5.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至4～8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類

4、而不同，細(xì)菌：每個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞：3~6個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；WORD資料下載可編輯專業(yè)技術(shù)資料分享絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種一次。5.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。5.3.2.1甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號(hào)比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小

5、試管，在-30℃冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用時(shí)，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。5.3.2.2液體石蠟保存法5.3.2.2.1無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121℃滅菌30分鐘,置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。5.3.2.2.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中

6、，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍或2～8℃冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕甘油冷凍管-30℃2年金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕銅綠假單胞菌（CMC

7、C（B）10104）枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕液體石蠟管2-8℃1年黑曲霉菌〔CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏5.4.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代5.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇5.4.1.1.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培養(yǎng)基WORD資料下載可編輯專業(yè)技術(shù)資料分享?改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；?液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；?

8、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；?改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b)用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安