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《幽門螺桿菌ahpc基因的克隆與原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、幽門螺桿菌ahpC基因的克隆與原核表達(dá)：李艷青，段廣才，宋春花，張建光，王淑玲，張衛(wèi)東，郗園林【摘要】目的構(gòu)建幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)ahpC基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化Ahp蛋白。方法用PCR方法從中國分離株MEL-Hp27的染色體DNA中擴(kuò)增出ahpC基因片段，將目的基因插入表達(dá)載體pET-30a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-ahpC。重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用鎳離子親和層析純化蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果PCR擴(kuò)增的ahpC基因長度為594bp，經(jīng)酶切和測
2、序分析，插入到載體的基因與GenBank公布的序列相似性達(dá)99%；SDS-PAGE顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出分子質(zhì)量為23ku的目的蛋白，且產(chǎn)量較高。結(jié)論成功構(gòu)建了ahpC表達(dá)載體pET30a-ahpC，并在大腸桿菌中高效表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；ahpC基因；克?。换虮磉_(dá)ChinaABSTRACT:ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionsystemofahpCgeneofHelicobacterpylori.MethodsTheahpCgeneplifiedfromHpchromosomalDNAbyPCRtechniq
3、ueandclonedintotheexpressionvectorpET-30a.TherebinantvectorpET30a-ahpCedtoE.coliBL21(DE3)forexpressionunderinductionbyIPTG.Theexpressionproductentthat.ConclusionAprokaryotichigh-expressionsystemforahpCgenehasbeensuccessfullyconstructed.Itcanhighlyexpressr-AhpCproteininE.coli. KEYEL-Hp2
4、7(簡稱Hp27)及質(zhì)粒pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和保存；鎳柱、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)購自創(chuàng)生公司；限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-TVector、Proteinmarker、T4DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA電泳膠回收、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京賽百盛生物工程公司完成，DNA測序由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。 1.2方法 1.2.1Hp基因組DNA的提取 刮取經(jīng)3d培養(yǎng)的
5、Hp培養(yǎng)板上的Hp，以12000r/min離心1min，取沉淀按細(xì)菌基因組抽提試劑盒操作方法提取HpDNA。 1.2.2AhpC編碼基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上公布的HpahpC基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列為：5′-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn)；P2的序列為：5′-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以Hp中國分離株MEL-Hp27基因組DNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃
6、預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循環(huán)35次，最后于72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察擴(kuò)增結(jié)果并用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?！ ?.2.3重組載體的構(gòu)建 回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T按照載體與插入DNA的摩爾比為1∶6的比例混合后，置16℃連接過夜，體系為pMD18-T載體1μL、PCR產(chǎn)物2μL、雙蒸水2μL、連接液5μL。經(jīng)藍(lán)白斑篩選鑒定的pMD18T-ahpC和表達(dá)載體pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，以10g/L瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行膠回收后，用T4DNA連接酶于22
7、℃進(jìn)行連接，pET-30a片段與插入DNA的摩爾比為1∶(1～3)。連接后的重組表達(dá)載體pET30a-ahpC再經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，以10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 1.2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 將重組載體pET30a-ahpC轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建的重組工程菌涂布含卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16h，挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。抽提質(zhì)粒，以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA堿基序列測定由北京三博志遠(yuǎn)生物有限責(zé)任公司完成?！ ?.2.
