鋅指蛋白265在大鼠睪丸sertoli細(xì)胞中的特異性表達(dá)

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1、鋅指蛋白265在大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞中的特異性表達(dá)：席曄斌,李榮平,王保國,葛瑜,沈天偉,蔣黎華,李偉毅【摘要】目的:研究鋅指蛋白265(ZNF265）在大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞中的特異性表達(dá)。方法:分離培養(yǎng)SD大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞,以免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測ZNF265在Sertoli細(xì)胞的表達(dá),且抽提Sertoli細(xì)胞總RNA,用PTPCR法檢測ZNF265的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)免疫熒光染色,實驗組Sertoli細(xì)胞核核周呈現(xiàn)明亮特異熒光,對照組未見特異性熒光;FCM檢測結(jié)果顯示實驗組Sertoli細(xì)胞ZNF265的表達(dá)

2、較對照組明顯增高;RTPCR擴(kuò)增出目的條帶ZNF265。結(jié)論:大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞特異性表達(dá)ZNF265,且多表達(dá)于Sertoli細(xì)胞核核周胞質(zhì)?！娟P(guān)鍵詞】ZNF265;Sertoli細(xì)胞;SD大鼠;ZNF265表達(dá)鋅指蛋白265（Zincfingerprotein265,ZNF265）由Karginova等［1］首先于大鼠腎球旁細(xì)胞中克隆。研究發(fā)現(xiàn),ZNF265在生物體中有廣泛的表達(dá),尤其在人類和小鼠生殖系統(tǒng)的表達(dá)具有特異性。目前研究認(rèn)為ZNF265具有RNA結(jié)合能力［2］,是一個參與細(xì)胞分化、發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控的多功能蛋白,與個體發(fā)育,

3、疾病密切相關(guān)。Sertoli細(xì)胞（支持細(xì)胞）是睪丸主要的基質(zhì)細(xì)胞,參與血睪屏障的組成和分泌細(xì)胞因子。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),Sertoli細(xì)胞在局部抗感染中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用,并參與、維持大鼠睪丸的免疫豁免［3,4］。本研究旨在探討ZNF265在大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步探討ZNF265的表達(dá)與Sertoli細(xì)胞的免疫功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料SD大鼠（雄性,15天齡,35g）,購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動科部。膠原酶II型、透明質(zhì)酸酶均購自EM/F12培養(yǎng)液購自Sigma公司。TritonX100購自Qbiog

4、ene公司。兔抗大鼠ZNF265抗體由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院生理學(xué)及生物物理系徐平教授惠贈。FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自KPL公司。奧林巴斯IX70倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司。固定/穿透工作液購自eBioscience公司。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）購自BD公司。TRIzol購自Invitrogen公司。SuperscriptII（K1622）試劑盒、2×PCRMasterMix試劑盒（K0171）均購自Fermentas公司。1.2.1Sertoli細(xì)胞的分離培養(yǎng)SD大鼠斷頸處死,無菌狀態(tài)分離取得睪丸組織,經(jīng)膠原酶II型

5、、透明質(zhì)酸酶消化、過濾、離心獲得高純度、高活率的Sertoli細(xì)胞［5］。在含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中于37℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)。1.2.2免疫熒光染色將分離得到的Sertoli細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中（培養(yǎng)板內(nèi)預(yù)置圓形玻片）培養(yǎng),待玻片細(xì)胞貼壁率為80％時,用預(yù)溫pH7.4的0.01mol/LPBS洗滌,甲醇固定10min（甲醇于-18℃預(yù)冷）,PBS洗滌,用0.02mL/LTritonX100透化破膜2～5min,PBS洗滌,然后加入0.5mL/L正常山羊血清,室溫封閉20min,PBS洗滌,加入兔抗大鼠Z

6、NF265抗體100μL,置于濕盒內(nèi)4℃過夜。次日PBS洗滌后,加入50μLFITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體,室溫避光30min,PBS洗滌3次,雙蒸水洗滌3次,最后950mL/L甘油封片,于倒置熒光顯微鏡下鏡檢。1.2.3流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析分離得到的Sertoli細(xì)胞按5×109/L密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),次日棄去培養(yǎng)瓶中的液體,用胰酶消化貼壁細(xì)胞,按5×105/管,加入流式管中。然后用冷PBS（含1000mg/LBSA）洗滌,1800r/min,離心10min,爾后加入1mL固定/穿透工作液,4℃作用1h,同上洗滌,再加入20μL兔抗大鼠Z

7、NF265抗體37℃孵育1h,同上洗滌。然后加入20μLFITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體,室溫避光15～20min,PBS洗滌3次,最后加入500μLPBS,流式細(xì)胞儀測定。1.2.4Sertoli細(xì)胞總RNA抽提按TRIzol試劑盒中的說明操作。1.2.5逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按SuperscriptII試劑盒中的說明操作。1.2.6PCR反應(yīng)引物的設(shè)計:（1）ZNF265引物:按大鼠ZNF265DNA全長序列,取自GenBank,序列號GI:13928843。5′端引物:5′caaggtcttcatcacgctca3′,3′端引物:5′cacggg

8、atctggaatgttct3′。目的基因產(chǎn)物的長度126bp。（2）βactin:按大鼠βactinDNA全長序列