糞大腸菌群操作細(xì)則

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1、糞大腸菌群多管發(fā)酵法1、培養(yǎng)基、試劑與儀器本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有注明外，均為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑；實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子水。單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：稱取23.0g乳糖蛋白胨營(yíng)養(yǎng)液于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全，分裝于含有倒置的小玻璃管的試管中，每試管約8ml（先用移液管吸取7ml至試管中，再用滴管吸取營(yíng)養(yǎng)液放至小玻璃管中，直至營(yíng)養(yǎng)液溢出。注意小玻璃管中不能有氣泡，若出現(xiàn)氣泡，應(yīng)將氣泡排出后再注入營(yíng)養(yǎng)液。），于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。EC培養(yǎng)液：稱取37.0gEC肉湯于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全，分裝于含有倒置的小玻

2、璃管的試管中，每管8ml（操作方法同單倍乳糖蛋白胨營(yíng)養(yǎng)液），于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。培養(yǎng)基的存放在密封瓶中的脫水培養(yǎng)基成品要存放在大氣濕度低、溫度低于30℃的暗處，存放時(shí)應(yīng)避免陽(yáng)光直接照射，并且要避免雜菌侵入和液體蒸發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。驗(yàn)所需儀器超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、冰箱、酒精燈、天平、電爐、500ml廣口瓶、燒杯、玻璃棒、玻璃發(fā)酵管、試管架、移液管、移液槍、接種環(huán)2步驟前期準(zhǔn)備器皿滅菌（高壓蒸汽滅菌）：所用采集水樣的廣口瓶、玻璃試管、移液管、玻璃棒、接種環(huán)、移液槍槍頭等器皿

3、均需放入高壓鍋滅菌。廣口瓶：將清洗干凈的采樣瓶蓋好瓶蓋，用牛皮紙、報(bào)紙等防潮紙將瓶蓋、瓶頂和瓶頸處包裹好，用繩子綁好，置于121℃的高壓蒸汽滅菌器滅菌15分鐘。玻璃試管（已經(jīng)裝好營(yíng)養(yǎng)液）、移液管、玻璃棒、接種環(huán)、移液槍槍頭：用牛皮紙、報(bào)紙等防潮紙將其包裹好，置于121℃的高壓蒸汽滅菌器滅菌15分鐘。采樣：采取水樣時(shí)，可握住瓶子下部直接將已滅菌的帶蓋采樣瓶插入水中，約距水面10~15cm處，拔瓶蓋，瓶口朝水流方向，使水樣灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶蓋，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平前推，直到充滿水樣為止。采好水樣后，迅速蓋上瓶蓋和包裝紙。采好的水樣，應(yīng)

4、迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行檢驗(yàn)，一般從取樣到檢驗(yàn)不宜超過2h，否則應(yīng)使用10℃以下的冷藏設(shè)備保存樣品，但不得超過6h。4.2水樣接種量將水樣充分混勻后，根據(jù)水樣污染的程度確定水樣接種量。每個(gè)樣品至少用三個(gè)不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有五管。相對(duì)未受污染的水樣接種量為10mL、1mL、0.1mL。受污染水樣接種量根據(jù)污染程度接種1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水樣量可參考下表1。(根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過紫外消毒的水樣取0.1mL、0.01mL、0.001mL體積進(jìn)行檢測(cè)，可根據(jù)水樣的潔凈度適當(dāng)調(diào)整取樣體積。)表1

5、接種用水量參考表如接種體積為10mL，則試管內(nèi)應(yīng)裝有三倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液5mL；如接種量為1mL或少于1mL，則可接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液10mL中。4.3初發(fā)酵試驗(yàn)將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中。在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽(yáng)性。4.4復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃溫度下培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)

6、性。5、結(jié)果的計(jì)算根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目，從表2或表3中查得每升水樣中的糞大腸菌群。接種水樣為100mL2份、10mL10份、總量300mL時(shí)，查表2可得每升水樣中的糞大腸菌群；接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時(shí)，查表3求得MPN指數(shù)，MPN值再乘10，即為1L水樣中的糞大腸菌群。如果接種的水樣不是10mL、1mL和0.1mL，而是較低的或較高的三個(gè)濃度的水樣量，也可查表3求得MPN值，再經(jīng)下式計(jì)算成每100mL的MPN值。6、接種過程①接種前的準(zhǔn)備工作a．檢查接種工具，進(jìn)行環(huán)境消毒：提前半小時(shí)將無(wú)菌室的紫外燈對(duì)環(huán)

7、境進(jìn)行消毒，進(jìn)入房間內(nèi)關(guān)閉紫外燈。實(shí)驗(yàn)開始前用75%醫(yī)用酒精將臺(tái)面和雙手進(jìn)行消毒）。b．在欲接種的培養(yǎng)基試管上貼好標(biāo)簽，標(biāo)上接種的菌名、操作者、接種日期等。c．將培養(yǎng)基、接種工具和其他用品全部放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上擺好，進(jìn)行環(huán)境消毒。②初發(fā)酵接種將移液槍調(diào)整至取樣體積值，裝上已消毒相應(yīng)的移液槍槍頭，分別取三個(gè)不同體積的水樣至已滅菌消毒的裝有單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中。復(fù)發(fā)酵接種方法：斜面接種③復(fù)發(fā)酵接種將菌種試管與待接種的試管培養(yǎng)基依次排列，挾于左手的拇指與其他四指之間，用右手的無(wú)名指與小指和手掌邊拔出棉塞并挾住。置試管口于酒精火焰附近。將接種工具垂直插入酒精火焰中

8、燒紅，再橫過火焰3次，然后再放入有菌試管內(nèi)，在管壁上