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《實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)報(bào)告》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、今年以來(lái)我們?cè)谏霞?jí)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)和區(qū)精神文明辦的關(guān)心支持指導(dǎo)下堅(jiān)持以鄧小平理論和三個(gè)代表重要思想為指導(dǎo)認(rèn)真落實(shí)科學(xué)發(fā)展觀實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)報(bào)告篇一：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介 一．實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理 理論上，PCR過(guò)程是按照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進(jìn)行模板的擴(kuò)增。但在實(shí)際的PCR反應(yīng)過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴(kuò)增，而是按線性的方式增長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。因此在起始模板量與終點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度間沒(méi)有可靠的相關(guān)性。如采用常規(guī)的終點(diǎn)檢測(cè)法（利用EB染色來(lái)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，從而
2、間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴(kuò)增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度。 為了能準(zhǔn)確判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系。 Ct值是如何得到的 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的過(guò)程中，靶序列的擴(kuò)增與熒光信號(hào)的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，定量PCR儀全程采集熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析軟件自動(dòng)按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號(hào)并設(shè)定閾值從而得到每個(gè)樣品的Ct值。緊緊圍繞中心工作以創(chuàng)建區(qū)級(jí)文明單位活動(dòng)為載體切實(shí)加強(qiáng)思想道德建設(shè)和企業(yè)文化建設(shè)深入開展群眾性的精神文明創(chuàng)建活動(dòng)今
3、年以來(lái)我們?cè)谏霞?jí)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)和區(qū)精神文明辦的關(guān)心支持指導(dǎo)下堅(jiān)持以鄧小平理論和三個(gè)代表重要思想為指導(dǎo)認(rèn)真落實(shí)科學(xué)發(fā)展觀 Ct值的定義 Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”代表檢測(cè)threshhold（閾值），其含義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴(kuò)增曲線與閾值線交點(diǎn)所對(duì) 應(yīng)的橫坐標(biāo)。 Ct值與樣品中模板的對(duì)應(yīng)關(guān)系 Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，y代表Ct值）?！ ∨c終點(diǎn)法相比利用Ct值的優(yōu)勢(shì) 由于Ct值是反映實(shí)際PCR反應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等
4、因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復(fù)性也更好。傳統(tǒng)的終點(diǎn)檢測(cè)法是在PCR擴(kuò)增經(jīng)歷了指數(shù)擴(kuò)增期進(jìn)入平臺(tái)期后利用EB等染料染色來(lái)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的精確度不高、重復(fù)性也不好。下圖中是96個(gè)復(fù)孔的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線（完全相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復(fù)性，而終點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度差異達(dá)到300個(gè)單位。緊緊圍繞中心工作以創(chuàng)建區(qū)級(jí)文明單位活動(dòng)為載體切實(shí)加強(qiáng)思想道德建設(shè)和企業(yè)文化建設(shè)深入開展群眾性的精神文明創(chuàng)建活動(dòng)今年以來(lái)我們?cè)谏霞?jí)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)和區(qū)精神文明辦的關(guān)心支持指導(dǎo)下堅(jiān)持以鄧小平理論和三個(gè)
5、代表重要思想為指導(dǎo)認(rèn)真落實(shí)科學(xué)發(fā)展觀 此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR還能從方法學(xué)上有效的防止PCR實(shí)驗(yàn)中交叉污染的問(wèn)題。因?yàn)闊晒舛縋CR中模板的擴(kuò)增與檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的，當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后即可獲得定量結(jié)果， 直接丟棄含有大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成二次污染的可能性。 二．熒光定量PCR的2類方法（按熒光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法） 染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)為497nm，發(fā)射波
6、長(zhǎng)為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時(shí)具有很低的熒光本底，當(dāng)反應(yīng)體系中存在dsDNA時(shí)，SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下?！ ∪玖戏ǖ膬?yōu)點(diǎn)：1，無(wú)需設(shè)計(jì)、合成探針，實(shí)驗(yàn)成本低；2，使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾乎相同?！ ∪玖戏ǖ娜秉c(diǎn)：1，由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴(kuò)增過(guò)程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴(kuò)增效率的降低、結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此采用該方法對(duì)于引物的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要求很高，確保反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有
7、非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增；2，由于SYBR緊緊圍繞中心工作以創(chuàng)建區(qū)級(jí)文明單位活動(dòng)為載體切實(shí)加強(qiáng)思想道德建設(shè)和企業(yè)文化建設(shè)深入開展群眾性的精神文明創(chuàng)建活動(dòng)今年以來(lái)我們?cè)谏霞?jí)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)和區(qū)精神文明辦的關(guān)心支持指導(dǎo)下堅(jiān)持以鄧小平理論和三個(gè)代表重要思想為指導(dǎo)認(rèn)真落實(shí)科學(xué)發(fā)展觀Green的上述特點(diǎn)，該方法不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。（在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因的表達(dá)情況） 探針?lè)ǎㄒ訲a
