發(fā)酵染菌檢查

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1、染菌的檢查、原因分析和防止措施染菌的檢查、原因分析和防止措施1.染菌的檢查與判斷在發(fā)酵過程中對(duì)雜菌污染的及早發(fā)現(xiàn)，及時(shí)處理，是免除染菌造成嚴(yán)重?fù)p失的重要問題。因此，要求有確切、迅速的方法來檢出雜菌的污染，目前常用方法主要有以下幾種：（1）顯微鏡檢查?通常用革蘭氏染色法，染色后在高倍顯微鏡下觀察。對(duì)霉菌、酵母發(fā)酵，先用低倍顯微鏡觀察生產(chǎn)菌的特征，然后再用高倍顯微鏡觀察有否染菌存在，根據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征區(qū)別，判斷是否染菌。必要時(shí)，可進(jìn)行芽孢和鞭毛染色。（2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法?先將經(jīng)滅菌的固體培養(yǎng)基倒入滅菌的平板中置培養(yǎng)箱攝氏37度，保溫24h檢

2、查無菌即可使用。將需要檢查的樣品，在無菌平板上劃線，分別置攝氏37度、攝氏27度培養(yǎng)，以適應(yīng)嗜中菌和低溫菌的生長，一般在8h后即可觀察。?噬菌體檢查可采用雙層平板培養(yǎng)法，底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基，上層減少瓊脂用量。先將滅菌的底層培養(yǎng)基熔后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基熔解并保持?jǐn)z氏40度，加生產(chǎn)菌作為指示菌和待檢樣品混合后迅速倒在底層平板上，置培養(yǎng)箱保溫培養(yǎng)，經(jīng)12~20h培養(yǎng)，觀察有無噬菌斑。培養(yǎng)基（PH7.0）???葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化鈉（%）瓊脂（%）上層??0.5?????1.0????1.0?????0.5?????1.0下層?

3、?0.5?????1.0????1.0?????0.5?????2.0（3）肉湯培養(yǎng)檢查法?將需要檢查樣品接入經(jīng)滅菌并經(jīng)過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基中，放置攝氏37度和攝氏27度分別培養(yǎng)24h，進(jìn)行觀察，并取樣鏡檢。此法常用于檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，也可用于噬菌體檢查，此時(shí)使用生產(chǎn)菌作為指示菌。?葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚紅溶液0.4%，PH7.2。?用以上的檢查方法檢查未發(fā)現(xiàn)污染，還不能肯定未被污染。?除以上方法外，還可以從發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象來判斷是否染菌，如溶解氧、PH值、排氣中CO2

4、含量和菌體酶活力等變化來判斷。2.發(fā)酵染菌率和染菌原因分析（1）發(fā)酵染菌率?發(fā)酵的總?cè)揪适侵敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。?發(fā)酵染菌是在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率，包括染菌后被挽救不了導(dǎo)致倒罐的批數(shù)，但種子罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導(dǎo)致發(fā)酵染菌的另行計(jì)算。（2）染菌原因分析?在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結(jié)發(fā)酵染菌的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重要措施。?造成發(fā)酵染菌的原因很多，但總結(jié)歸納起來，其主要原因有：無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善。在發(fā)生染菌后，根據(jù)無菌試驗(yàn)結(jié)果

5、，參考以下方法進(jìn)行分析，找出原因，杜絕污染。（A）?從染菌時(shí)間來看，發(fā)酵早期染菌，可能原因有：種子帶菌，培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底，接種操作不當(dāng)，無菌空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌，可能原因有：中間補(bǔ)料污染，設(shè)備滲漏，操作問題。（B）?從污染的雜菌種類來看，污染耐熱的芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；污染球菌、無芽孢桿菌等不耐熱雜菌可能是種子帶菌，設(shè)備滲漏；污染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題。（C）從染菌的幅度來看，如果各個(gè)發(fā)酵罐或多個(gè)發(fā)酵罐染菌，而且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題；如果各別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。?以上僅僅是在分析問題時(shí)

6、作為考慮問題的入門，應(yīng)根據(jù)具體情況綜合分析，且通過進(jìn)一步的無菌檢查來驗(yàn)證。3.雜菌污染途徑及預(yù)防（1）種子帶菌及防止?種子帶菌的原因主要有以下幾方面（A）培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底?菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進(jìn)行，造成滅菌不徹底主要是滅菌時(shí)鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時(shí)溫度還達(dá)不到要求。（B）菌種在移種過程中受污染?菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進(jìn)行。當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)，或無菌室管理不嚴(yán)，就可能引起污染。因此，要嚴(yán)格無菌室管理制度和嚴(yán)格按無菌操作接種，合理設(shè)計(jì)無菌室。（C）菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染?菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由

7、于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，不宜太松，且有一定長度，培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。每一級(jí)種子培養(yǎng)物均應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格檢查，確認(rèn)未受污染才能使用。（2）無菌空氣帶菌及防止?無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一。杜絕無菌空氣帶菌，必須從空氣凈化流程和設(shè)備的設(shè)計(jì)，過濾介質(zhì)的選用和裝填，過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。（3）培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防止?培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個(gè)方面有關(guān)（A）原料形狀一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而淀粉質(zhì)原料，特別是有顆粒時(shí)，容易由于滅菌不徹底，

8、造成染菌。淀粉質(zhì)培養(yǎng)基滅菌以采用實(shí)罐滅菌為好，在升溫時(shí)先攪拌混合均勻，并加一定量