發(fā)酵染菌的檢查

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1、染菌的檢查、原因分析和防止措染菌的檢查、原因分析和防止措施仁染菌的檢查與判斷在發(fā)酵過程中對雜菌污染的及早發(fā)現(xiàn)，及時處理，是免除染菌造成嚴(yán)重?fù)p失的重要問題。因此，要求有確切、迅速的方法來檢出雜菌的污染，目前常用方法主要有以下幾種：（1）顯微鏡檢查通常用革蘭氏染色法，染色后在高倍顯微鏡下觀察。對霉菌、酵母發(fā)酵，先用低倍顯微鏡觀察生產(chǎn)菌的特征，然后再用高倍顯微鏡觀察有否染菌存在，根據(jù)*產(chǎn)菌?朵菌的特征區(qū)別,判斷是否染菌。必要時，可進(jìn)行芽砲和鞭毛染色。（2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢杳法先將經(jīng)滅菌的固體培養(yǎng)棊倒入滅菌的平板中置培養(yǎng)箱攝氏37度，保溫24h檢查無菌即可使用。將需要檢查的樣品，在

2、無菌平板上劃線，分別置攝氏37度、攝氏27度培養(yǎng)，以適應(yīng)嗜中菌和低溫菌的生長，一般在8h后即可觀察。噬菌體檢查可采用雙層平板培養(yǎng)法，底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基，上層減少瓊脂用雖。先將滅菌的底層培養(yǎng)基熔后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基熔解并保持?jǐn)z氏40度，加生產(chǎn)菌作為指示菌和待檢樣甜混合后迅速倒在底層平板上，置培養(yǎng)箱保溫培養(yǎng)，經(jīng)12-20h培養(yǎng)，觀察有無噬菌斑。培養(yǎng)基（PH7.0）匍萄糖（％）牛肉膏（％）蛋白月東（%）氯化鈉（％）瓊脂（％）上層0.51.01.00.51.0下層0.51.01.00.52.0(3)肉湯培養(yǎng)檢杳法將需要檢查樣品接入經(jīng)滅菌并經(jīng)過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基屮，放置攝氏3

3、7度和攝氏27度分別培養(yǎng)24h,進(jìn)行觀察，并取樣鏡檢。此法常用丁?檢查培養(yǎng)基和無菌空氣是否帶菌，也可用于噬菌體檢查，此時使用生產(chǎn)菌作為指示菌。葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%,匍萄糖0.5%,氯化鈉0.5%,蛋⑷東0.8%,1%酚紅溶液0.4%,PH72用以上的檢查方法檢查未發(fā)現(xiàn)污染，還不能肯定未被污染。除以上方法外，還可以從發(fā)酵過程的界?，F(xiàn)象來判斷是否染菌，如溶解氧、PH值、排氣中C02含量和菌體酶活力等變化來判斷。2發(fā)酵染菌率和染菌原因分析(1)發(fā)酵染菌率發(fā)酵的總?cè)揪适侵敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。發(fā)酵染菌是在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率，包括染菌后被挽救不了導(dǎo)致倒

4、罐的批數(shù)，但種了罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導(dǎo)致發(fā)酵染菌的另行計算。(2)染菌原因分析在發(fā)酵染菌Z后，必須分析染菌原因，總結(jié)發(fā)酵染菌的經(jīng)驗教訓(xùn)，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生Z前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重耍措施。造成發(fā)酵染菌的原因很多，但總結(jié)歸納起來，其主耍原因有:無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失課和技術(shù)管理不善。在發(fā)生染菌后，根據(jù)無菌試驗結(jié)果，參考以下方法進(jìn)行分析，找出原因，杜絕污染。(A)從染菌時間來看，發(fā)酵早期染菌，可能原因有：種了帶菌，培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底，接種操作不當(dāng)，無菌空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌，可能原因冇：中間補(bǔ)料污染，設(shè)備滲漏，操作問題。(B)從污染的雜

5、菌種類來看，污染耐熱的芽砲桿菌，可能是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；污染球菌、無芽抱桿菌等不耐熱雜菌可能是種子帶菌，設(shè)備滲漏；污染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題。(C)從染菌的幅度來看，如果各個發(fā)酵罐或多個發(fā)酵罐染菌，而且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題；如果各別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。以上僅僅是在分析問題時作為考慮問題的入門，應(yīng)根據(jù)具體情況綜合分析，且通過進(jìn)一步的無菌檢查來驗證。3.雜菌污染途徑及預(yù)防（1）種子帶菌及防止種子帶菌的原因主耍有以下幾方而（A）培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底菌種培養(yǎng)基及用具火菌均在火菌鍋屮進(jìn)行，造成火菌不徹底主要是滅菌時鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假

6、壓，使滅菌時溫度還達(dá)不到要求。（B）菌種在移種過程屮受污染菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進(jìn)行。當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)，或無菌室管理不嚴(yán)，就可能引起污染。因此，要嚴(yán)格無菌室管理制度和嚴(yán)格按無菌操作接種，合理設(shè)計無菌室。（C）菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程［I'受污染菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，不宜太松，且有-淀長度，培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太人。每一級種了培養(yǎng)物均應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格檢杏，確認(rèn)未受污染才能使用。（2）無菌空氣帶菌及防止無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一。杜絕無菌空氣帶菌，必須從空氣凈化流程和設(shè)備的

7、設(shè)計，過濾介質(zhì)的選用和裝填，過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方血完善空氣凈化系統(tǒng)。（3）培養(yǎng)基和設(shè)備火菌不徹底導(dǎo)致染菌及防止培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底的原因，主耍與以下幾個方面有關(guān)（A）原料形狀—般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而淀粉質(zhì)原料，特別是有顆粒時，容易山于滅菌不徹底,造成染菌。淀粉質(zhì)培養(yǎng)基滅菌以采用實(shí)罐滅菌為好，在升溫時先攪拌混合均勻，并加一定量的淀粉酶邊加邊液化。（B）實(shí)罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣實(shí)罐滅菌時，罐內(nèi)空氣未完全排除，造成“假壓”，使罐頂空間局部溫度達(dá)不到滅菌要求