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1、對于人腦膠質(zhì)瘤骨橋蛋白的表達(dá)【神經(jīng)膠質(zhì)瘤Expressionandsignificanceofosteopontininhumangliomas 【AbstractAIM:ToinvestigatetheexpressionofosteopontininhumangliomasasannormalbraincellsandgliomacellsmunohistochemicalstainingandRTPCRmethod.RESULTS:Osteopontinacellsbutannormalbraincells.CONCLUSION:Osteopontinexpressioni
2、ngliomaiscloselyrelatedtothemalignantdegreeofglioma. 【Keya;osteopontin;immunohistochemistry 【目的：探索骨橋蛋白（OPN）在人腦膠質(zhì)瘤中的功能、表達(dá)及其意義.方法：采用RTPCR及免疫組化染色方法檢測腦膠質(zhì)瘤組織和正常組織中骨橋蛋白.結(jié)果：骨橋蛋白在膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中表達(dá)，而在正常腦組織細(xì)胞中無表達(dá)，而且OPN的表達(dá)濃度和膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān).結(jié)論：人腦膠質(zhì)瘤中OPN的表達(dá)和其惡性程度密切相關(guān). 【神經(jīng)膠質(zhì)瘤；骨橋蛋白；免疫組織化學(xué) 0引言 人腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長是術(shù)后復(fù)發(fā)和臨床療效
3、差的主要原因，過程涉及到細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移等多個環(huán)節(jié).骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是一種含有整合素結(jié)合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它對于OPN的黏附功能起重要功能.整合素是OPN的受體，OPN通過細(xì)胞黏附序列GRGDS識別整合素和細(xì)胞結(jié)合，刺激了細(xì)胞信號的傳送途徑，促進(jìn)了細(xì)胞的黏附和遷移，促使了細(xì)胞向惡性發(fā)展［1-3］，我們采用免疫組化和RTPCR方法，探索OPN在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá). 1材料和方法 1.1材料 河南省人民醫(yī)院200308/200502手術(shù)切除膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移和正常腦組織標(biāo)本共36例.按ED生物技術(shù)公司.按操縱說明進(jìn)行各組的OP
4、N免疫組化染色.扼要步驟：30mL/L過氧化氫室溫孵育，DH2O沖洗，PBS浸泡，100mL/L山羊血清封閉；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，PBS沖洗；滴加生物素標(biāo)記二抗，PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記物，顯色劑(DAB)顯色.陽性對照用已知OPN表達(dá)陽性的組織切片，陰性對照用PBS代替一抗，以胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽性細(xì)胞. 1.2.2總RNA的提取和RTPCR①每0.1g組織中加進(jìn)1mLTrizol，提取總RNA并按說明書操縱.②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總RNA4μg,0.5g/Loligo(Dt)1μL,加進(jìn)一定量DPEC處理水,使總體積少于15μL，放70℃5min.
5、將反應(yīng)體系立即置冰上，再加進(jìn)5mmol/LBuffer6μL,10mmol/LdNTP1μL,833.5μkat/LRNAsin0.5μL,3.334mkat/LMMLV1μL,用DPEC處理水定容于30μL.37℃1h,94℃5min.③PCR：將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增.引物是自行設(shè)計并由上海生物有限公司合成.OPN上游引物序列為5′CTGATGCTACAGACGAGGAC3′(668687)；下游引物序列為5′ACTATCAATCACATCGGAAT3′（912893）；內(nèi)參照G3PDH上游引物序列為5′GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG3′(90113)；下游引物序列
6、為5′CCTCCGACGCCTGCTTCACCA3′(877856).50μL的反應(yīng)體系中加進(jìn)10mmol/Lbuffer2μL,25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP1μL,G3PDH引物各1μL,OPN引物各1μL,83.35μkat/LTaq酶0.5μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL,加DEPC處理水至50μL.94℃5min預(yù)變性，94℃30s→55℃1min→72℃80s,共30個循環(huán)，72℃10min,4℃冷卻后-20℃保存.④電泳及定量分析：PCR產(chǎn)物行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，結(jié)果為OPN灰度值/G3PDH灰度值. 統(tǒng)計學(xué)
7、處理：各組織相對積分值以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異比較采用非參數(shù)秩和檢驗. 2結(jié)果 在正常腦組織中(Fig1)未見棕黃色或棕色陽性顆粒，即沒有表達(dá)OPN，而在膠質(zhì)瘤組織(Fig2)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中以及血管內(nèi)皮細(xì)胞均見棕黃色或棕色陽性顆粒，即表達(dá)OPN.且IV級膠質(zhì)瘤組織中OPN的表達(dá)要比II級膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯增加（Tab1）.表1RTPCR檢測OPNmRNA在正凡人腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量（略） 3討論 OPN是
