分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展

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1、分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展張?。ㄉ虾Ｊ信R床檢驗(yàn)中心，200126）摘要：分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使分子診斷技術(shù)進(jìn)入常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用技術(shù)，越來越多的分子診斷實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)用于疾病的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后判定。不同的分子診斷方法具有不同的臨床應(yīng)用范圍，本文根據(jù)分子診斷技術(shù)特征，按照雜交、擴(kuò)增和測序三種技術(shù)特征，對近期分子診斷技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應(yīng)用方面的進(jìn)展做一綜述。關(guān)鍵詞：分子診斷熒光原位雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因測序高通量狹義的分子診斷（moleculardiagnosis）是基于核酸的診斷技術(shù)，通過對DNA和／或RNA的檢測來實(shí)踐對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成

2、，以及由此而帶來的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域［1］。當(dāng)然，分子診斷學(xué)的快速發(fā)展，得益與分子診斷技術(shù)的日新月異。1990年啟動(dòng)的人類基因組計(jì)劃的完成經(jīng)歷了十三年的時(shí)間，而2007啟動(dòng)的1000人基因組計(jì)劃的完成卻只用了3年［2］，人類了解自然密碼的速度正在跨上快速列車。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)以提供精密準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)服務(wù)于臨床，而分子診斷技術(shù)正逐漸成為成為常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室的

3、應(yīng)用技術(shù)，這將為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供巨大的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。本文將根據(jù)分子診斷技術(shù)特征，按照雜交、擴(kuò)增和測序三種技術(shù)特征，對近期分子診斷技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應(yīng)用方面的進(jìn)展做一綜述。一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應(yīng)用兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交（molecularhybridization）。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交（southernBlot和northernBlot）到實(shí)時(shí)PCR（realtimePCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基

4、互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。而且在理論上可以特異性相互作用的兩個(gè)不同分子，例如核酸與核酸之間（A-G、G-C）、蛋白與蛋白之間（抗原和抗體）甚至核酸和蛋白之間（適體與多肽）的相互作用都可以視為分子雜交的不同表現(xiàn)模式。因此，廣義的分子雜交技術(shù)是指以核酸、蛋白、糖基以及細(xì)胞、代謝物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前臨床應(yīng)用的以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)繁多，缺乏統(tǒng)一的分類方法，但是可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的差異分為主要的兩種類型，一類是通過特異性的標(biāo)記探針檢測檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)，而另一類是通過探針檢測從細(xì)胞內(nèi)提取的核酸、蛋白等物質(zhì)，前者以原位雜交及其衍生的技術(shù)為主，后者以生物芯片及其衍生的技

5、術(shù)為主。1、原位雜交技術(shù)（insituhybridiztion，F(xiàn)ISH）的發(fā)展與臨床應(yīng)用：原位雜交應(yīng)用特異性的探針檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸需要標(biāo)記分子顯示雜交信號，1960s年代的檢測技術(shù)是放射性核素標(biāo)記，但是信號檢測程序復(fù)雜并且可能存在放射性物質(zhì)的污染，而熒光物質(zhì)標(biāo)記可以通過顯微鏡直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)（Fluorescentinsituhybridiztion，F(xiàn)ISH）一經(jīng)出現(xiàn)立刻取代了放射性標(biāo)記的技術(shù)，成為應(yīng)用最廣泛的分子雜交技術(shù)。FISH技術(shù)通過熒光標(biāo)記探針，可以可視化的檢測人類細(xì)胞或組織中特定基因的數(shù)量及其定位，是分子雜交與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合。IFS

6、H技術(shù)的分析過程分為四個(gè)步驟，核酸變性、探針變性、雜交及信號檢測。因此，針對探針標(biāo)記、染料開發(fā)和圖像分析的技術(shù)的更新是FISH分析技術(shù)發(fā)展的主要路徑。首先是熒光染料的應(yīng)用，從最初的單色FITC應(yīng)用，發(fā)展到使用多種熒光染料的多色FISH技術(shù)（multicolor－FISH，1996）［3］，既多元熒光原位雜交（Multiplex－FISH，M-FISH）［4］和光譜核型分析技術(shù)（Spectralkaryotying，SKY）［5］，使用五種染料（Rhodamine,Texas-red,Cy5,FITC,andCy5.5）標(biāo)記的探針可以在一次試驗(yàn)中定位多種不同的基因以及使用不同的顏色

7、標(biāo)記顯示24條不同的染色體。其次，在探針方面，為了更精細(xì)和高分辯的顯示染色體結(jié)構(gòu)和基因的探針，染色體臂、著絲粒、端粒特異的探針被先后開發(fā)應(yīng)用，而且應(yīng)用微切割技術(shù)切割技術(shù)制備亞區(qū)域探針（microFISH），使FISH的基因定位和分辯率大大提高［6］。同時(shí)，探針標(biāo)記對象和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展不斷衍生出新的FISH技術(shù)，例如比較基因組雜交（comparativegenomichybridization，CGH）、引物原位標(biāo)記技術(shù)（PrimedInSituLabeling，PRINS））、肽