生物技術論文

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1、青霉素酶產生菌蠟樣芽孢桿菌的篩選、純化和誘導徐冰（天津農學院農學系）1前言β-內酰胺酶（青霉素酶）在自然界的各種細菌中廣為存在,能夠水解各種β-內酰胺類抗生素,是臨床致病菌最重要的耐藥機制之一。但同時我們可以利用許多非致病菌產生的β-內酰胺酶能夠水解β-內酰胺類抗生素的特點,開發(fā)其在抗生素藥品質量檢驗、新抗菌藥物篩選等方面的應用。一些抗菌藥物如青霉素、磺胺類藥物、四環(huán)素及某些氨基糖甙類抗生素能使部分人群發(fā)生過敏反應。過敏反應癥狀多種多樣,輕者表現(xiàn)為蕁麻疹、發(fā)熱、關節(jié)腫痛及蜂窩織炎等;嚴重時可出現(xiàn)過

2、敏性休克,甚至危及生命。當這些抗菌藥物殘留于動物性食品中進入人體后,就使部分敏感人群致敏,產生抗體。當這些被致敏的個體再接觸這些抗生素或用這些抗生素治療時,這些抗生素就會與抗體結合生成抗原抗體復合物,發(fā)生過敏反應。英國一對青霉素高度敏感的病人,食用約含10IU/mL青霉素的商品牛奶后,發(fā)生了變態(tài)反應。在我們平常的生活中由于青霉素的大量使用使環(huán)境遭到了破壞，給人類帶來了不便。催化水解青霉素β-內酰環(huán)產生青霉噻唑酸的一類β-內酰胺酶。國際生物化學聯(lián)合會（IUB）酶學委員會的酶編號為3.5.2.6。在各

3、種微生物中分布廣泛，特別在細菌中更為廣泛。由蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus5/B與B.cereus569分別得到分子量為35200與31500的青霉素酶結晶，從巨大芽孢桿菌B.megaterium提取出α，β，γ青霉素酶結晶，隨后從不同細菌又分離出多種青霉素酶。青霉素酶對熱極不穩(wěn)定，分解β-內酰胺的速度因青霉素與酶的種類不同而異，但對6-氨基青霉烷酸（6-APA）作用卻很微弱。酶反應最適PH值為6.0～6.5.以青霉素G鉀鹽為底物，Km為4.32×10-3M(5/B酶)；4.89×10-

4、3M(569酶)。細菌產生青霉素酶導致出現(xiàn)耐藥性，臨床上已分離出多種類型青霉素酶，白色粉末。分子量50000。溶于水。酶溶液易失活，凍干品2～8℃可穩(wěn)定一周。青霉素酶作用于青霉素的β-內酰胺環(huán)，使青霉素轉變?yōu)闊o抗菌活性的青霉素酮酸（penicilloicacid）。醫(yī)療上用于青霉素過敏癥狀的治療。青霉素酶在實驗中用于破壞或抑制青霉素活性-12-β-內酰胺酶（β-lactamase），可水解β-內酰胺類抗生素。已發(fā)現(xiàn)二百多種β-內酰胺酶。青霉素酶的分類方法主要有兩種，分子生物學方法和BUSH法。??

5、?　　分子生物學法將酶分為四類。A類酶包括多種質粒編碼的青霉素酶，活性部位為絲氨酸殘基，分子量為29kDa。B類酶為金屬酶，由染色體或質粒編碼，酶活性需鋅離子參與，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。C類酶的活性部位為絲氨酸殘基，分子量為39kDa，其產生與誘導劑有關。C類酶主要指染色體編碼的頭孢菌素酶（AmpC酶）。D類酶又稱為OXA型（水解苯唑西林）β-內酰胺酶。???另一種分類方法為BUSH分類法，依底物及抑制劑譜不同，也將酶分為4類。第一類為頭孢菌素酶（AmpC酶），由染色體介導。第二類為青

6、霉素酶和超廣譜酶。第三類為金屬酶。第四類為其它不能被克拉維酸完全抑制的青霉素酶。由于青霉素的大量使用和亂用帶來的一些危害，我們有必要來生產青霉素酶來分解青霉素，這樣可以減少一些青霉素過敏反應帶來的危害，也可以減少亂用青霉素帶來的環(huán)境污染。這使青霉素敏感人群的安全性得到了進一步的提高，使我們的環(huán)境更加安全。青霉素G是目前醫(yī)藥工業(yè)中的最重要抗生素類產品,具有抗菌活性強,療效高,毒性低等優(yōu)點,一直是治療敏感性細菌感染的首選藥物。我國青霉素年生產能力達到12000噸以上,占全球年產量的50%,是世界青霉素

7、生產大國[2]。青霉素G結構中的β-內酰胺環(huán)不穩(wěn)定,在酸、堿、高溫、酶等作用下發(fā)生降解,生成的物質易與蛋白或多肽結合,生成致敏性高分子雜質,導致過敏反應的發(fā)生[3]。青霉素過敏反應表現(xiàn)形式多種多樣，以過敏性休克最為嚴重，常常發(fā)病迅速。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為呼吸道阻塞癥狀（呼吸困難、胸悶）;循環(huán)衰竭（大汗淋漓、紫紺、脈搏細弱、血壓下降）;中樞神經系統(tǒng)紊亂（意識障礙、昏迷、抽搐、大小便失禁等）。目前工業(yè)生產中大多采用溶媒萃取法從發(fā)酵液中分離青霉素G,pH118～2.5時用乙酸丁酯進行萃取,pH6.8～8

8、.0時用碳酸氫鈉進行反萃取,然而收率只有80%～90%,據文獻報道[4],其主要原因由青霉素G不穩(wěn)定降解造成。醫(yī)學界流行一句話:在美國買槍很容易,但買抗生素卻很難,而中國正好相反。目前,中國的門診感冒患者約有75%應用抗生素,外科手術則高達95%,世界衛(wèi)生組織調查表示,中國住院患者抗生素藥物使用率高達80%,其中使用廣譜抗生素和聯(lián)合使用兩種以上抗生素的占58%,遠遠高于30%的國際水平[5]。專家說凡超時、超量、不對癥使用或未嚴格規(guī)范使用抗生素,都屬于抗生素濫用[6]。我們常看到這