抑制性消減雜交技術介紹

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1、September20,2021寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司Clontech抑制性消減雜交技術介紹主要內(nèi)容2Clontech相關產(chǎn)品3實驗流程4參考文獻1抑制性消減雜交技術概述抑制性消減雜交(SSH)---DiatchenkoL,etal.PNAS1996;93:6025-6030Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries抑

2、制性消減雜交技術不同豐度的單鏈DNA得到均衡雜交動力學目的基因得到富集抑制性PCR抑制性消減雜交—原理采用兩次消減雜交和兩次PCR,保證了高特異性;通過雜交操作,可以獲得低豐度差異表達基因;使用SMARTer?PCRcDNASynthesisKit(634925/26)合成cDNA,只需2ng總RNA;操作簡便,實用有效,全過程僅需3-4天。假陽性率低、特異性高、靈敏度高、操作簡便、周期短抑制性消減雜交—特點構(gòu)建消減cDNA文庫研究細菌毒力的相關基因研究病原體感染后的應答基因鑒定抗病毒相關基因......抑制性消減雜

3、交—應用PCR-SelectTMcDNASubtractionKit(CatNo.637401)高效富集差異表達基因PCR-SelectTMBacterialGenomeSubtractionKit(CatNo.637404)分析細菌基因組差異序列ClontechPCR-SelectTM相關產(chǎn)品處理組非處理組TesterDriver正向消減DriverTester反向消減抑制性消減雜交實驗方法0.5~2μgpolyA+RNA0.01~1μg總RNA傳統(tǒng)方法合成cDNASMARTerTMPCR方法合成cDNARsaI限

4、制性內(nèi)切酶酶切cDNA末端接頭連接兩次消減雜交兩次PCR擴增富集差異表達基因SMARTer?PCRcDNASynthesisKit(634925/26):從2ng總RNA中合成cDNASMARTer?PicoPCRcDNASynthesisKit(634928):從低至1ng的總RNA中合成cDNA實驗流程雜交動力學抑制性PCR由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程TestercDNA+Adaptor1Teste

5、rcDNA+Adaptor2R由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程TestercDNAwithAdaptor1TestercDNAwithAdaptor2RDrivercDNA(過量)ABCDABCD由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDTester雜交液(Adaptor1)ABCDTester雜交

6、液(Adaptor2R)DrivercDNA(加熱變性)A,B,C,DE由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊A,B,C,DABCDE末端補齊EE實驗流程由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDE加入共用PCR引物A,D:不能被擴增C:線性擴增B:擴增受到抑制E5’3’3’5’EE非特異性表達基因得到極大的扣除

7、,高效地富集了差異表達基因。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程E5’3’3’5’加入巢式PCR引物E由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊瓊脂糖凝膠電泳檢測,RNA有兩條明顯的帶28S和18S,亮度在2:1左右。OD260/OD280為1.8~2.2。哺乳動物poly+ARNA0.5~12kb,非哺乳動物0.5~

8、3kb。M小鼠肝臟總RNA28S18S5S實驗過程要點分析M:Marker1:未酶切的dscDNA2:酶切后的dscDNA人類骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好,需要重新抽提純化cDNA,重新進行酶切。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗過程

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