抑制性消減雜交

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1、抑制性消減雜交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技術(shù)是一種鑒定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術(shù).其原理是以抑制性多聚酶鏈反應(PCR)反應為基礎的cDNA消減雜交技術(shù).通過合成兩個不同的接頭,連接于測試cDNA片段的5’末端,達到選擇性擴增差異性表達的cDNA片段,抑制非目的cDNA的擴增.該技術(shù)與其他消減雜交技術(shù)相比具有假陽性率低、敏感性高、效率高等優(yōu)點而得到廣泛應用.1抑制性消減雜交技術(shù)產(chǎn)生的背景高等真核生物細胞中約含有4-10萬個不同的基因,但在生物體的發(fā)育過程中只有15%的基因得以表達.

2、這些基因的選擇性表達決定了生物體的各項生命活動:個體的發(fā)育和分化、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持、細胞周期的調(diào)控、衰老、細胞凋亡等.因此要了解人體各項生命活動的調(diào)控機制,就必須將這些差異表達的基因分離、鑒定并作深入研究,為此人們建立了一系列研究基因表達差異的方法.cDNA消減雜交技術(shù)是一類較早建立的技術(shù)[1],其原理是將要比較基因表達差異的雙方cDNA進行雜交,通過羥基磷灰石層析、親和素-生物素結(jié)合等方法,從雜交混合物中分離、鑒定出未雜交的部分.應用這些方法曾分離、鑒定出一些重要基因,例如T細胞受體(TCR)等,但不能有效獲得低豐度的轉(zhuǎn)錄物,需多步的雜交層析過程

3、.1992年Liangetal[2,3]建立了mRNA差異顯示法(mRNAdifferentialdisplay)或稱差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(differentialdisplayreverseranscriptionPCR,DD-RT-PCR),其特點是原理簡單、靈敏度高,但是假陽性率高達70%.1993年Lisitsynetal[4,5]在進一步完善DD-RT-PCR基礎上發(fā)展了代表性差異分析法(representationaldifferenceanalysis,RDA),該技術(shù)充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)擴增雙鏈模板,而以線性擴增單鏈模板的特性,

4、通過消減和富集,使得目的基因片段得到特異性擴增,但仍需多次雜交、PCR步驟,較為繁瑣.1994年Hubanketal[6]將RDA技術(shù)改良,設計了cDNA-RDA方法,該方法用于比較具有相近遺傳背景、表型不同的兩組cDNA之間的差異,但如果兩組cDNA之間存在較大差異,以及某些基因在檢測子中存在上調(diào)表達時,此方法顯得力不從心,很難達到預期的目的.1996年Diachenkoetal[7,8]在RDA的基礎上發(fā)展了抑制性消減雜交技術(shù),他克服了DD-RT-PCR法的假陽性較高和RDA法消減雜交輪次較多的缺點,適用于克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及

5、其功能.2抑制性消減雜交方法的原理抑制性消減雜交技術(shù)是一種以抑制性PCR反應為基礎,將標準化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù).通過合成兩個不同的接頭,接于經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的測試cDNA片段的5’末端,將測試和驅(qū)動進行兩輪雜交.標準化步驟均等了測試中的cDNA單鏈豐度,消減雜交步驟去除測試和驅(qū)動之間的共同序列.利用抑制性PCR選擇性擴增目的cDNA片段,同時抑制非目的cDNA的擴增.因此,抑制性消減雜交技術(shù)顯著增加了獲得低豐度差異表達的cDNA的概率.所謂抑制性PCR是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火,使非目的序列片段兩端的長反向重復序

6、列在退火時產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu),無法與引物配對,從而選擇性抑制非目的序列片段擴增[9].抑制性消減雜交技術(shù)的基本實驗過程如下.首先,將要進行比較的兩種組織或細胞來源的mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA,把含有目的基因的cDNA稱為測試(tester),把參考cDNA稱為驅(qū)動(driver),用同一種限制性內(nèi)切酶RsaI切割,產(chǎn)生末端平頭的片段,將測試cDNA分為兩份,每份連接不同的接頭,即:接頭1(adaptor1)和接頭2(adaptor2).接頭為雙鏈DNA片段,且5’-端均無磷酸基,這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA的5’-末端連接,兩個接頭含

7、有可識別的序列.接下來進行兩次雜交.第一次雜交在每個測試里加入過量驅(qū)動,然后變性、退火,根據(jù)雜交動力學第二定律,即豐度越高的分子退火速度越快,因此測試cDNA與驅(qū)動cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子,使得差異表達的單鏈分子得到富集.第二次雜交,將進行過首次雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合,只有剩下的經(jīng)過消減并平均化了的差異表達的單鏈cDNA可以重新結(jié)合為新的雜交體分子,這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2,加入新鮮變性的驅(qū)動進行第二輪消減雜交,進一步富集差異表達的雜交體分子,并用DNA酶補平末端,這樣差異表達的測試序列-雜交體分子5'-和

8、3'-端就有了進行巢式PCR所需的不同的退火位點.最后,進行兩次PCR反應,第一次PCR只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段才得以指

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