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《胃癌中mir-638對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其分子機制研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、胃癌中miR-638對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其分子機制研宄1.河南省安陽地區(qū)醫(yī)院4550002.屮國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院100088國家自然科學(xué)基金項目:低劑量輻射對樹突狀細(xì)胞遷移能力影響及其分子機制研究,課題編號:81202151[摘要]目的:闡釋胃癌屮miR-638對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響,并證明它可能是通過影響細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋內(nèi)VASP的表達水平來抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機制。方法:通過Westernblot檢測VASP蛋白表達水平;劃痕損傷修復(fù)實驗檢測H癌細(xì)胞遷移能力;構(gòu)建Pc
2、DNA6.2-miR-638的真核表達載體,轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞BGC-823,過表達miR-638,通過劃痕損傷修復(fù)實驗檢測癌細(xì)胞遷移能力.結(jié)果:與對照組相比,過表達VASP3’UTR使VASP蛋白水平增加(P<0.05);過表達VASP3’UTR能促進胃癌細(xì)胞遷移(P<0.05);與對照組相比,過表達miR-638抑制胃癌細(xì)胞的遷移(P<0.05);結(jié)論:過表達VASP3’UTR增加VASP蛋白水平,促進胃癌細(xì)胞的遷移;過表達miR-638能抑
3、制胃癌細(xì)胞的遷移;miR-638直接靶向VASP3’UTR抑制胃癌細(xì)胞的遷移。[關(guān)鍵詞]胃癌;miR-638;血管擴張刺激磷蛋0;遷移;侵襲本文用芯片篩選胃癌和癌旁組織的micmRNA差異表達譜1-2,發(fā)現(xiàn)miR-610、miR-638下調(diào)倍數(shù)分別為0.522和0.283;生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-610、miR-638可以與VASPmRNA3’非翻譯區(qū)不完全互補配對;本實驗以miR-638為契入點,培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC-823,利用westernblot、PCR、劃痕
4、損傷修復(fù)實驗、luciferase報告基因?qū)嶒灥葘嶒灱夹g(shù),證實外源性過表達VASP3’UTR能促進R癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移3。1材料與方法1.1材料主要試劑:DMEM培養(yǎng)基;胎牛血清;胰蛋白酶;EDTA-Na2.2H2O;十二烷基磺酸鈉Sigma;N,N,-亞甲雙丙烯酰胺Fluka;丙烯酰胺Amresco;TEMEDSigma;單克隆鼠抗人VASP抗體AlexisBiochemicals;兔抗人GAPDH抗體Santacruze;HRP或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgGSantacruze;HRP或A
5、P標(biāo)記的羊抗兔IgGSantacruze;BCA蛋白濃度測定試劑盒北京普利萊公司;DAB顯色試劑盒北京天根公司;其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。主要儀器:顯微鏡:XDS-1B倒置顯微鏡,北京順杰欣隆有限公司;DMBRI倒置相差熒光顯微鏡:LEICA,Germany;BIO-1D凝膠成像系統(tǒng):法國VilberLourmat公司;超聲破碎儀:美國Sonics&Materials公司;凝膠成像分析系統(tǒng):Syngene;PCR儀:Eppendorf;SpectraMaxM2多功能酶標(biāo)儀:Molecular
6、Devices,USA;其余儀器均為國產(chǎn)。胃癌細(xì)胞BGC-823:BGC-823細(xì)胞由我院保存。質(zhì)粒:pcDNA6.2-miR-GW/EmGFPvector購自invitrogen。菌株:DH5α,本實驗室保存。引物:定購自invitrogen公司。1.2實驗方法真核表達載體pcDNA6.2-VASP3’UTR的構(gòu)建:參考文獻[4-5]方法制備載體PCDNA6.2大片段;以質(zhì)粒pCMVSPORT-VASP-cDNA為模板,擴增大小為803bp的VASP3’UT
7、R目的片段;用DNA純化試劑盒回收目的基因酶切后產(chǎn)物。挑取單克隆菌落,37°C搖床振蕩培養(yǎng)12?16hr(250rpm),次日提取質(zhì)粒pcDNA6.2-VASP3’UTR,送英駿公司(Invitrogen)測序。測序結(jié)果冋來后,取測序結(jié)果正確的pcDNA6.2-VASP3’UTR質(zhì)粒做轉(zhuǎn)化,然后使用北京天根公司的質(zhì)粒小提試劑盒提質(zhì)粒。真核表達載體pcDNA6.2-miR-638的構(gòu)建:步驟同上。細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞的換液和傳代:胃癌細(xì)胞MKN-28和BGC-823用1640培養(yǎng)
8、基+10%的胎牛血清+1%的雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每次換液用無菌PBS洗細(xì)胞一到兩次,再加入培養(yǎng)基培養(yǎng);待細(xì)胞長至80%~90%滿吋,用胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞的凍存:先制備細(xì)胞凍存液,選對數(shù)生長期的細(xì)胞,用胰酶消化細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,移入凍存管,放入凍存盒至-80°C冰箱,24小吋后取出,放入盒子-80°C保存。脂質(zhì)體法將重組的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞:細(xì)胞鋪六孔板:六孔板每孔鋪5×105細(xì)胞,加入2ml無抗生素的培養(yǎng)基,37°C,5%CO2培養(yǎng)24小吋,待細(xì)胞生長融合至70%?80%