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1、IRAS基因敲除小鼠構建及相互影響蛋白篩選前言自可樂定的降壓作用被發(fā)現(xiàn)以后，人們研究表明它可以通過降低血清中兒茶酚胺的濃度而使血壓降低。最早提出咪唑啉類化合物概念的是Ruffolo[1]，他發(fā)現(xiàn)咪唑啉類衍生物特拉唑嗪可以拮抗羥甲唑啉引起的平滑肌收縮作用，而對苯乙胺類去甲腎上腺素類藥物（如甲氧明、去氧腎上腺素等）引起的平滑肌收縮無效。1984年，Bousquet在麻醉貓的延髓頭端腹外側（RVLM）微注射可樂定發(fā)現(xiàn)可引起降壓作用，而同樣方式給予2腎上腺素受體激動劑沒有產生降壓作用，由此發(fā)現(xiàn)了咪唑啉受體的存在[2]；其后Ernsberger也采用放射性配體結合實驗證實在相同腦區(qū)有咪
2、唑啉特異性結合位點[3]。1.咪唑啉受體相關研究在咪唑啉受體結構和功能方面：人們最初發(fā)現(xiàn)了兩個不同的咪唑啉受體亞型。研究較清楚的是I2咪唑啉受體，最早稱為I2咪唑啉結合位點，根據(jù)對阿米洛利親和性的不同又將其分為兩個亞型，I2A和I2B；在腦、肝、腎等組織均有分布。Tesson等研究發(fā)現(xiàn)，I2咪唑啉受體主要定位于細胞線粒體外膜上[4]；后證實I2咪唑啉結合位點是單胺氧化酶（MAO）的調節(jié)亞基[5]。I1咪唑啉結合位點是可樂定高親和力結合位點，主要分布于皮層和延髓腹外側。I1咪唑啉受體激動劑主要作用于該受體，通過激活磷脂酶C活化MAPK，進而激活ERK產生生物學效應；其最主要的作
3、用是中樞血壓調節(jié)[6]，研究表明I1咪唑啉受體激動劑的降壓過程中還有S1P受體[7]以及G蛋白偶聯(lián)的內向整合鉀通道參與[8]，同時在RVLM腦區(qū)有c-jun基因表達的下降[9]。此外采用藥理學研究技術發(fā)現(xiàn)，利美尼定腎臟灌流，在不影響血壓的前提下具有排鈉利尿作用[10]，推測腎臟中也存在I1咪唑啉受體[11]。莫索尼定還能抑制胃腺分泌、保護胃粘膜[12]，抑制大鼠胰島素的分泌等[13]。在咪唑啉配體方面：1994年，作為一種可樂定替代物質（clonidine-displacingsubstance，CDS），Li等從牛腦中純化得到了胍丁胺，它可以與2-腎上腺素受體以及咪唑啉受體
4、結合，刺激腎上腺髓質嗜鉻細胞分泌兒茶酚胺；以后研究發(fā)現(xiàn)腦內存在胍丁胺合成所需的左旋精氨酸脫羧酶。因此，研究者首次提出胍丁胺是咪唑啉受體的內源性激動劑[14]。1996年，Kolesnikov等首次報道胍丁胺能增強阿片鎮(zhèn)痛、對抗阿片耐受作用[15]。本課題組前期對胍丁胺的藥理學作用開展了深入細致地研究。首先，我們研究發(fā)現(xiàn)在小鼠醋酸扭體模型上外源性胍丁胺本身具有弱的鎮(zhèn)痛作用（ED50=10.4mg/kg）；在小鼠熱輻射甩尾試驗中，胍丁胺可以協(xié)同嗎啡的鎮(zhèn)痛作用；另一方面，外源性胍丁胺可以逆轉和預防嗎啡引起的耐受、軀體依賴和精神依賴；咪唑啉受體拮抗劑咪唑克生能夠抑制胍丁胺的上述藥理作
5、用[16,17]，表明胍丁胺的作用可能與激活咪唑啉受體相關。我們采用藥理學的方法上調或下調內源性胍丁胺水平后，發(fā)現(xiàn)阿片的藥理作用同樣受到了影響：使用左旋精氨酸脫羧酶抗體抑制胍丁胺的合成后，可使嗎啡的鎮(zhèn)痛作用減弱、并加重了嗎啡耐受；相反，當用胍丁胺酶抑制劑二氟甲基鳥氨酸或氨基胍使內源性胍丁胺水平升高后，嗎啡的鎮(zhèn)痛作用得到加強而嗎啡誘導的耐受則受到抑制[18]。上述結果從兩方面說明，內源性和外源性胍丁胺對阿片受體系統(tǒng)的藥理學作用具有雙向調節(jié)作用，即一方面增強阿片的鎮(zhèn)痛作用，另一方面能抑制阿片誘導的耐受和依賴。由于胍丁胺被認為是咪唑啉受體的內源性配體，而且I1咪唑啉受體拮抗劑咪唑克
6、生能夠對抗胍丁胺的上述作用，提示我們胍丁胺的這種作用可能是通過I1咪唑啉受體介導的。2.IRAS蛋白的發(fā)現(xiàn)及其結構和功能研究IRAS蛋白的發(fā)現(xiàn)：在上述藥理學研究工作的基礎上，國內外部分學者開始將研究重點放在尋找咪唑啉受體蛋白上。1998年，Ivanov制備了兩種抗體，一種于親和純化的咪唑啉結合蛋白，另一種則于抗咪唑啉類化合物的抗體。雖然不同，但采用兩種抗體同時在多種組織中檢測到了85kD的ain，是細胞內常見的蛋白功能結構域[39]，介導信號轉導、囊泡轉運、蛋白分選等多種生理功能。所以該功能殘留是可以接受的。第二部分相互作用蛋白的篩選....741.材料方法......741
7、.1.質粒構建........741.2.酵母雙雜交......751.2.1.試劑....751.2.2.酵母雙雜交的基本流程......761.2.3.酵母轉化流程：......761.2.4.文庫篩選......771.2.5.自激活鑒定....771.3.免疫共沉淀......771.3.1.試劑材料......771.3.2.免疫共沉淀步驟......781.4.熒光能量共振轉移（FRET）....781.5.哺乳動物雙雜交........781.5.1.試劑儀器......781.5.2.操
