brd7基因在小鼠各組織中表達及基因敲除小鼠模型的構(gòu)建

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1、原創(chuàng)性聲明ifllHHIHfllllliHiIIIY2198910本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含有獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：關(guān)于學位論文使用授權(quán)恂說明本人了解中南大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)保留學位論文，允許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨紝W位

2、論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文；學?？筛鶕?jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學位論文。本課題受如下基金資助：國家重大科學研究計劃(資助號：2006CB910500)國家自然科學基金項目(批準號：81071686；81171934)碩士學位論文中文摘要摘要BRD7是我室自主克隆的一個鼻咽癌候選抑瘤基因，具有阻止細胞周期G1．S期進程、始動細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)細胞惡性生物學行為的特征。該基因能結(jié)合和識別乙酰化組蛋白H3，是Bromodomain家族成員之一。BRD7通過參與ras／MEK／

3、ERK、Rb／E2F和Wnt等多條信號通路實現(xiàn)抑瘤功能，是一個在鼻咽癌發(fā)病過程中與細胞周期和凋亡密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。盡管BRD7基因抑瘤功能和作用機制研究已經(jīng)取得了突破性的進展，但仍然缺乏強有力的體內(nèi)實驗依據(jù)。新近發(fā)展的基因敲除技術(shù)是利用同源重組原理使特定的靶基因失活進而實現(xiàn)在其功能缺失的情況下分析靶基因功能的方法。通過基因剔除，可以從整體和細胞水平上反映基因剔除后一系列表型的改變。為此，本課題以C57BL／6小鼠為研究模型，一方面系統(tǒng)比較鼠源性BRD7與人BRD7基因在mRNA序列和氨基酸序列上的

4、同源性，并研究其在小鼠全身各組織中的表達規(guī)律；另一方面利用Cre／LoxP系統(tǒng)，探索基因剔除小鼠模型構(gòu)建和鑒定的方法，構(gòu)建BRD7條件性剔除小鼠模型，為體內(nèi)研究BRD7的抑瘤功能、全面考察BRD7參與正常生理、疾病發(fā)生的功能和機制奠定堅實基礎(chǔ)。具體實驗結(jié)果如下：一．鼠源性BRD7的序列特征和表達1．鼠源性BRD7的序列特征C57BL是小鼠的一個品系，是一種常見的基因剔除研究動物模型。C57BL小鼠BRD7(mBRD7)的編碼框序列為1956bp，含17碩士學位論文中文摘要個外顯子，編碼651個氨基酸。人B

5、RD7(hBRD7)的編碼框序列同為1956bp，含13個外顯子，亦編碼651個氨基酸。mBRD7的mRNA和氨基酸序列與hBRD7的同源性均高達88％，說明C57BL小鼠中BRD7發(fā)揮的功能與人體組織中BRD7發(fā)揮的功能類似，是BRD7基因剔除小鼠構(gòu)建的最佳小鼠品系。2．mBRD7在小鼠全身各組織中的表達規(guī)律研究通過數(shù)字化表達分析(電子雜交)，mBRD7在腦、眼睛、心臟、肝、肺、胰腺、皮膚、睪丸、腸、血液、骨和前列腺等表達水平較高，在肌肉、唾液腺、胃等組織中表達較低，是一個存在廣泛表達的保守基因。進一步

6、通過熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)mBRD7的平均CT值為24．2個循環(huán)，GAPDH的平均CT值為19．0個循環(huán)，其mRNA表達水平是GAPDH的1／36．76。BRD7在小鼠全身各組織中整體表達處于中低度水平，呈泛表達，但在睪丸、附睪、精囊腺、生精管等雄性生殖相關(guān)的組織以及脾、肺、外耳等組織中表達較高，推測BRD7可能與小鼠雄性生育存在某種關(guān)聯(lián)。二．BRD7基因剔除小鼠模型的構(gòu)建1．BRD7LoxPl．2蚺小鼠的構(gòu)建和鑒定LoxP插入的雜合子小鼠(Flox小鼠)是條件性基因剔除小鼠過程中的重要步驟，系與上海南

7、方模式生物研究中心合作完成。整個制備過程包括條件性打靶載體的構(gòu)建、胚胎干細胞的基因打靶、陽性ES細胞克隆的篩選、重組ES細胞囊胚腔注射、嵌合體小鼠的獲得等，通過毛色和基因型鑒定獲得LoxP插入的雜合子小鼠(BRD7一LoxPl．2弘小鼠)。在獲得BRD7LoxPl．2“小鼠的基礎(chǔ)上，抽提小鼠尾巴gDNA，分別采用兩對針對LoxPl、LoxP2位點的引物和針對野生型等位基因(WT)的引物進行PCR擴增和測序鑒定，證實BRD7LoxPl．2+／=／J-、鼠碩士學位論文中文摘要構(gòu)建成功。2．BRD7LoxP3+

8、／+／1x鼠的構(gòu)建和鑒定取BRD7LoxPl-2+／'／1x鼠雌雄雜交，分別以子代鼠gDNA為模板，采用針對LoxPl、LoxP2和WT的引物進行PCR擴增鑒定，獲得基因型為BRD7LoxPl．2+／+／JN鼠；然后與EII．Cre+／+d,鼠雜交，通過PLoxPl、PLoxP2、PLo)(P3、PWT和Pc托五對引物對子代鼠進行PCR擴增和鑒定，獲得基因型為BRD7LoxP3“Cre+／。小鼠；再進一步與基因型為BRD7lo