β射線誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡

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1、β射線誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡【關(guān)鍵詞】188,Re　　關(guān)鍵詞:188Re;凋亡;β射線;肝癌細(xì)胞　　0引言　　凋亡或細(xì)胞程序性死亡是一種不同于細(xì)胞壞死的死亡方式，是在基因控制下的有序死亡，是一個主動性自殺過程，常伴有特征性形態(tài)學(xué)和生化變化.臨床上放射線治療腫瘤主要應(yīng)用射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一機(jī)制.188Re發(fā)射2110KeV的β射線，155KeVγ射線，半衰期17h，具有良好的核物理性質(zhì).國外188Re的研究主要在188Re標(biāo)記單克隆抗體對腫瘤的放射免疫治療，并顯示具有一定的療效，而國內(nèi)關(guān)于188Re的研究較少，經(jīng)文獻(xiàn)檢索未見有關(guān)于188Re誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)旨在

2、研究188Re-β射線誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系hHCC（humanhepatomacarcinomacell，人原發(fā)性肝癌細(xì)胞）凋亡的形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞周期，以探討其發(fā)生機(jī)制.　　1材料和方法　　1.1材料吖啶噔染料（AO染料），美國Amersco公司.188Re可由188-2000EX電子顯微鏡.　　1.2方法　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法hHCC（中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫）培養(yǎng)于含100mL・L-1小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)瓶中，培育箱37℃，含50mL・L-1CO2.1.2.2吖啶噔染色標(biāo)本的制備10mg吖啶噔加入100mLPBS，溶解、過濾

3、、4℃避光保存.用6孔板接種hHCC，每孔1×105;在另一板上設(shè)陰性對照，即只加細(xì)胞不加放射性核素188Re，分箱培養(yǎng).以7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188Re分別加入hHCC培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)72h，將細(xì)胞消化吹下，制備成細(xì)胞懸液，取95μL細(xì)胞懸液，加入5μL吖啶噔儲存液，混勻，吸一滴混合液滴在載玻片上，加上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察、照相.　　1.2.3透射電鏡標(biāo)本的制作hHCC1×105接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h，換液，加入188Re11.1MBq，繼續(xù)培養(yǎng)72h.棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞消化下來，以1000r・min-1離心8m

4、in，棄上清，加入30mL・L-1戊二醛固定，然后加入10mg・L-1鋨酸固定，再經(jīng)程序脫水、滲透、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鉛鈾染色，透射電鏡下觀察.　　1.2.4流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制作hHCC以1×105接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h，換培養(yǎng)液，分別加入3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188Re，培養(yǎng)72h，另設(shè)陰性對照細(xì)胞，分箱培養(yǎng).將細(xì)胞消化下來，PBS洗2遍，調(diào)整成1×109・L-1單細(xì)胞懸液，取1mL細(xì)胞再加2mL4℃無水乙醇，吹散混勻，封口膜4℃保存24h以上.上流式細(xì)胞儀前，用PBS再洗

5、一次，加碘化丙錠染色，測定DNA含量變化，分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況.　　2結(jié)果　　2.1熒光顯微鏡形態(tài)觀察hHCC經(jīng)不同劑量188Re照射后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、死亡現(xiàn)象.正常細(xì)胞的細(xì)胞核DNA呈黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)為橘黃色熒光，凋亡細(xì)胞的胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色熒光，甚至有黃綠色凋亡小體，壞死細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色熒光均減弱甚至消失.陰性對照的細(xì)胞核形態(tài)完整、清晰，呈均勻的黃綠色熒光，胞核中有空泡，細(xì)胞質(zhì)為橘黃色，形態(tài)完整.7.4MBq劑量細(xì)胞大致完整，胞核清楚，胞膜清晰無破裂，壞死細(xì)胞少見，細(xì)胞內(nèi)熒光基本如對照組，染色均勻，凋亡細(xì)胞少見，11.1，14.

6、8MBq劑量組黃綠色深染的凋亡細(xì)胞較多，如圖1示其胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色熒光顆粒，甚至可見整個細(xì)胞固縮，明顯的黃綠色致密濃染的熒光，分不清胞核與胞質(zhì)，另見與胞體脫離的黃綠色濃染的數(shù)個凋亡小體呈圓形，細(xì)胞膜有偽足樣突起.18.5，22.2MBq細(xì)胞大多死亡，死亡細(xì)胞黃綠色熒光減弱，染色淺淡，壞死細(xì)胞大多破裂，胞質(zhì)流失，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則（圖2）.　　2.2電鏡觀察凋亡肝癌細(xì)胞微絨毛脫失，染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊邊集，細(xì)胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松與胞膜融合，形成一個個空泡.線粒體縮小，結(jié)構(gòu)無明顯變化（圖3）.　　圖1－圖3略　　2.3流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞一個標(biāo)志是，在

7、正常細(xì)胞G1峰前面出現(xiàn)一個DNA含量減少的“G1亞峰”，用流式細(xì)胞儀分析陰性對照，3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq細(xì)胞周期結(jié)果（圖4）.　　熒光顯微鏡觀察表明在陰性對照和7.4MBq劑量組，細(xì)胞基本正常，胞核完整，黃綠色熒光染色均勻，細(xì)胞質(zhì)為橘黃色，胞膜無破裂，凋亡少，死亡細(xì)胞少，說明劑量低時不足以誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡，在11.1，14.8MBq劑量組凋亡細(xì)胞出現(xiàn)最多，在18.5，22.2MBq時可見細(xì)胞呈雪花狀大片壞死，這說明大劑量照射后細(xì)胞凋亡和其他形式的細(xì)胞死亡是造成細(xì)胞減少的共同原因，也說明合適的照射劑量可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不致其死亡，

8、表明188