半夏蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞bel7402的誘導(dǎo)凋亡作用

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1、半夏蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel7402的誘導(dǎo)凋亡作用【摘要】目的觀察并比較半夏蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞Bel7402的生長(zhǎng)抑制作用。方法應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)半夏蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel7402的誘導(dǎo)凋亡作用，并觀察了其誘導(dǎo)凋亡作用的量效關(guān)系。結(jié)果60%硫酸銨沉淀蛋白沒(méi)有明顯誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞凋亡的作用，而30%硫酸銨沉淀蛋白有誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞凋亡的作用。30%沉淀進(jìn)一步分離結(jié)果顯示，只有0.1mol/LNaCl洗脫峰有一定誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)論半夏蛋白有一定的誘導(dǎo)Bel7

2、402細(xì)胞凋亡作用，其主要成分可能存在于總有機(jī)酸部位?！娟P(guān)鍵詞】半夏提取物；人肝癌細(xì)胞Bel7402；細(xì)胞凋亡　　Abstract：ObjectiveTostudytheinducingapoptosiseffectsofPinelliaternateprotEinonhumanhepatomacelllinebel7402.MethodsFloetryeeffects,and0.1mol/LNaCldepositoryproteinform30%(NH4)2SO4depositionalsoshoeeff

3、ects.ConclusionThePinelliaternateproteinhassomeeffectsofinducingapoptosisofBel7402,andprobablythetotalorganicacidisthemaininducingapoptosisparts.　　KeyanhepatomacelllineBel7402;Apoptosis半夏臨床上可單獨(dú)或與其它藥物配伍用于治療食管癌、卵巢癌及肝癌等。近年來(lái)對(duì)抗癌中藥的研究發(fā)現(xiàn)，其作用途徑主要是通過(guò)殺傷癌細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)

4、細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的［1］。研究也發(fā)現(xiàn)，半夏乙醇提取液、半夏總有機(jī)酸、掌葉半夏蛋白分別對(duì)肝癌細(xì)胞（HepG2）、胃癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞具有抑制作用［2～4］。然而不同產(chǎn)地半夏及其類似品所含的蛋白抗癌作用有何差異，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本文擬采用不同提取方法，觀察并比較不同產(chǎn)地的半夏蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel7402的誘導(dǎo)凋亡作用?！　?器材與試劑　　1.1藥物來(lái)源半夏鮮品采自湖北鐘祥，經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院鑒定教研室鑒定為正品?！　?.2試劑與配制DMSO、胰蛋白酶氯霉素、青霉素、EDTA購(gòu)自Amresco公司

5、；RPMI1640（GIBCO產(chǎn)品）；RNase酶、碘化丙啶（PI）均購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清（三利生物制品廠）。醋酸乙酯、石油醚、95%乙醇等其它均為國(guó)產(chǎn)分析純?！　?.3細(xì)胞系及培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系Bel7402由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）提供，用50ml的培養(yǎng)瓶，將人肝癌細(xì)胞系（Bel7402）接種于含100u/ml青霉素、0.1g/L鏈霉素和10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度為2×104ml，置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?！　?.4儀器SHEL

6、LRBCO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；Olympus倒置顯微鏡；SHZ82A恒溫震蕩器；無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；流式細(xì)胞儀（BD公司FACSCalibur型）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭離心機(jī)廠）；902型定時(shí)恒溫磁力攪拌器；LDZX40立式電熱壓力蒸氣滅菌器等。　　2方法及結(jié)果　　2.1半夏蛋白的提取分離新鮮塊莖半夏洗凈去皮，加入4倍體積0.05mol/LTrisHcl(pH8.0)緩沖液及少量石英砂，高速勻漿后離心（8000r/min，30min），收集上清液，即得粗蛋白。粗蛋白冷卻到0℃，逐步加入固體（

7、NH4）2SO4，當(dāng)飽和度達(dá)到30%時(shí)，4℃靜置2h離心（8000r/min，30min），收集沉淀，得第1個(gè)分級(jí)沉淀部分。上清液繼續(xù)加（NH4）2SO4至60%飽和度，4℃靜置2h后離心（8000r/min,30min），收集沉淀，得第2個(gè)分級(jí)沉淀部分。上清液加（NH4）2SO4至90%飽和度，靜置無(wú)沉淀。將上述2個(gè)分級(jí)沉淀部分分別用蒸餾水溶解，裝入透析袋（透過(guò)分子量8000），用蒸餾水在4℃透析脫鹽，更換透析液在檢測(cè)不出（NH4）2SO4為止，把透析袋放入吸水性強(qiáng)的聚乙二醇（PEG，分子量20000）中，濃

8、縮至小體積離心后去除沉淀。將層析柱豎直固定在儀器車上，將DEAESepharoseFF膠裝入層析柱中，用0.05mol/LTrisHCl(pH8.0)緩沖液平衡樹脂，將30%（NH4）2SO4沉淀部分溶解后以0.5ml/min上柱，分別以0.05mol/LTrisHCl，0.05mol/LNaCl,0.10mol/LNaCl,0.15mol/LNaCl,0.20mol/LNaCl溶