質(zhì)粒的提取與純化

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1、實驗一質(zhì)粒的提取(堿法)實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒瀮x器、材料與試劑實驗步驟實驗結(jié)果及討論實驗?zāi)康牧私鈮A法提取質(zhì)粒的原理；掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。實驗原理質(zhì)粒是一種細菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實驗室常用的方法。這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離它們。結(jié)構(gòu)的三大要素：多克隆位點選擇標記（耐藥性，LacZ）獨立的復(fù)制單位種類：質(zhì)粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉(zhuǎn)錄病毒載體表達載體等pBCSKmapT-載體在堿性條件（pH12.5）下，線性染色體DNA的雙螺旋結(jié)

2、構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂但兩條互補鏈彼此纏繞，緊密結(jié)合在一起。當(dāng)加入乙酸鉀恢復(fù)至中性時，染色體DNA分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒DNA分子很快復(fù)性，離心時染色體DNA與細胞碎片一起被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)粒DNA。實驗儀器、材料與試劑（一）儀器1.恒溫搖床2.超凈工作臺3.高壓滅菌鍋4.高速臺式離心機5.微量取液器（二）材料含pBCKS質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α。含重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α。（三）試劑1.LB液體培養(yǎng)基（1L）胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去離子水至800ml攪拌，使

3、溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基（1L）在上述LB液體培養(yǎng)基（1L）中加入瓊脂粉15g。2.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?.SolutionⅡ(現(xiàn)用現(xiàn)配制)0.2mol/LNaOH1%SDS4.SolutionⅢ（100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L鉀鹽、5mol/L醋酸（pH4.8）。5.氨芐青霉素

4、（Amp）用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.胰RNA酶將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。實驗步驟質(zhì)粒的提取1.用滅菌的牙簽挑取單菌落放入50mlLB液體培養(yǎng)基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2.將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm離心1min，去掉上清液，重復(fù)兩次。沉淀懸于200μLSoluti

5、onI中,渦旋使充分懸浮。3.加入300μLSolutionII，混勻（注意動作輕），冰箱3℃放置5min。4.加入300μLSolutionIII,混勻（注意動作輕），冰箱3℃放置5min。5.12,000rpm，離心5min，將上清移至1個新Eppendorf管中，注意所取體積（約600μL）。6.加入等體積氯仿（約600μL），混勻（注意動作輕）。12,000rpm，4℃，離心10min，取上清液。7.上清液中加入預(yù)冷的等體積異丙醇，-20℃沉淀20~30min。8.12,000rpm離心15min。9.去上清，沉淀加入500μL70%乙醇洗滌2次（

6、12,000rpm離心3分鐘）。10.去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。11.每管中加入25μL無菌水1μLRNase，37℃溶解質(zhì)粒DNA。Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（實際用）操作過程1.將1～1.5ml過夜培養(yǎng)的細菌菌液加入1.5ml離心管中。2.于10，000rpm離心30秒，并棄去上清液。如有需要，可多次重復(fù)步驟1、2，以收集更多細菌菌體。但勿過量，以免影響提取質(zhì)粒的質(zhì)量。3.加250μlResuspensionBuffer，重懸細菌體沉淀。重懸后應(yīng)該沒有細菌團塊。4.加250μl細胞LysisBuffer，輕柔顛倒4～6

7、次。不要劇烈振動，以防止基因組DNA被剪切。注意不要讓反應(yīng)持續(xù)超過5分鐘。5.加350μlNeutralizationBuffer，立即輕柔顛倒離心管4～6次。溶液應(yīng)該出現(xiàn)絮狀物，但不會出現(xiàn)局部沉淀。6.于13,000rpm離心10分鐘。如離心機轉(zhuǎn)速不夠可延長離心時間，直至形成緊密的白色沉淀。7.將步驟6離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到Spincolumn內(nèi)。于6,000rpm離心1分鐘，并棄去接液管內(nèi)液體。8.向Spincolumn內(nèi)加650μlWashBuffer，于12，000g離心30～60秒，并棄去接液管內(nèi)液體。9.重復(fù)第8步一次。10.再次于12，00

8、0rpm離心1分鐘，然后將Spincolumn轉(zhuǎn)移到無菌的1.5m