下肢缺血預(yù)處理對(duì)大鼠心肌基因表達(dá)的影響

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1、下肢缺血預(yù)處理對(duì)大鼠心肌基因表達(dá)的影響張冬會(huì)趙曉云邢邯英盧亞敏龐國勛司翠權(quán)【摘要】目的通過觀察經(jīng)下肢缺血預(yù)處理的心肌梗死大鼠心肌中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）和血紅素加氧酶1（HO1）mRNA的表達(dá)，探討其在缺血心肌中的作用。方法將SD雄性大鼠隨機(jī)分為心肌梗死組（40只）和下肢缺血預(yù)處理組（40只）；每組按缺血時(shí)間又分為1、2、4、6、12h組。顯微鏡下計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞；HE染色觀察心肌組織中浸潤白細(xì)胞的數(shù)值。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RTPCR）測(cè)定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)心肌組織中HIF1α和

2、HO1mRNA表達(dá)。結(jié)果下肢缺血預(yù)處理后12h組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及心肌組織中白細(xì)胞浸潤數(shù)目較心梗組顯著減少（P＜0.05）；心肌中1、2、4hHIF1αmRNA表達(dá)與心梗組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異（P＜0.01）。各時(shí)間點(diǎn)HO1mRNA表達(dá)與心梗組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著差異（P＜0.01）。結(jié)論經(jīng)下肢缺血預(yù)處理后，心肌損傷減輕，HIF1α和HO1可能與心肌保護(hù)作用有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】下肢；缺血預(yù)處理；心肌梗死目前，心肌缺血預(yù)處理(ischemicpreconditioning，IPC)已從

3、心臟擴(kuò)展到心外組織，如下肢、腎臟、骨骼肌等，其短暫缺血不僅能減輕局部組織或器官的缺血損傷，而且對(duì)遠(yuǎn)隔組織和器官也有保護(hù)作用，被證明是最有效的內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制。Ockaili等〔1〕的研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）誘導(dǎo)的血紅素加氧酶1（HO1）表達(dá)上調(diào)對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用。但有關(guān)HIF1α和HO1mRNA在下肢缺血預(yù)處理中的作用機(jī)制尚未明了。本研究旨在闡述這兩種基因在下肢缺血預(yù)處理對(duì)心肌梗死大鼠心肌的作用?！　?材料與方法　　1.1材料主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶（AMVRT）、dN

4、TP、TaqDNA聚合酶、隨機(jī)引物、瓊脂糖均購自美國Promega公司。HIF1α、HO1及βactin上下游引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。主要儀器：奧林帕斯顯微鏡（日本）；數(shù)字彩色顯微圖像分析系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀(PE5700)（美國）。　　1.2動(dòng)物分組與模型制作選擇雄性SD大鼠80只，體重250～300g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1in，開放5min，反復(fù)4次，隨后進(jìn)行LAD結(jié)扎。各組均在操作結(jié)束后1、2、4、6、12h處死大鼠。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)

5、8只。心臟取血計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞，取心尖部分提取總RNA，另取部分心肌組織固定包埋行HE染色?！　?.3HIF1α和HO1mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)　　1.3.1總RNA提取Trizol一步法提取組織總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA的吸收度(A)值，A260/A280＞1.8認(rèn)為RNA較好無降解。采用20μl反應(yīng)體系：總RNA2μg，隨機(jī)引物1μl，加去離子水補(bǔ)至10μl，70℃水浴5min，迅速放冰上5min。然后再加MMLV1μl，RNA酶抑制劑1μl，4×dNTP1μl，5×MMLV緩沖液

6、4μl，37℃水浴4h合成cDNA，所得cDNA-20℃保存?！　?.3.2目的基因PCR擴(kuò)增向優(yōu)化體系中加入以下成分：引物1、2各5pmol/L，cDNA2μl，去離子水補(bǔ)足20μl。在擴(kuò)增儀上進(jìn)行RTPCR，PCR的反應(yīng)參數(shù)：HIF1α95℃5min；94℃30s，53℃30s，68℃1min，循環(huán)35次；68℃延伸5min。HO1為94℃2min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min。βactin為94℃5min；94℃35s，56℃35s，72℃

7、35s，循環(huán)35次；72℃延伸5min。4℃終止反應(yīng)。　　1.3.3RTPCR產(chǎn)物半定量取RTPCR產(chǎn)物8μl行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，80V，45min，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與βactin擴(kuò)增產(chǎn)物灰密度掃描之比作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1?！　”?RTPCR反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增片段長度（略）　　1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析,如有顯著性差異,再進(jìn)一步用組間兩兩比

8、較q檢驗(yàn)?！　?結(jié)果　　2.1組間外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較LIP組心梗后12h外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于AMI組（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)組間比較無顯著性差異。見表2?！　?.2兩組心肌組織中白細(xì)胞浸潤情況心梗后12hLIP組心肌組織中白細(xì)胞浸潤數(shù)目較AMI組減少（P＜0.05）。見表3。　　表2外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（略）　　與AMI組比較：1）P＜0.05；下表同　　2.3兩組HIF1α、HO1mRNA表達(dá)情況預(yù)處理后1hHIF1αmRNA開始升高，2h達(dá)高峰，4h后開始降低，較對(duì)