invader化學(xué)檢測(cè)法在高危型hpv中應(yīng)用

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1、Invader化學(xué)檢測(cè)法在高危型HPV中應(yīng)用摘要：目的：應(yīng)用Invader化學(xué)檢測(cè)法對(duì)HPV-DNA進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)HPV感染的基因型別預(yù)測(cè)受檢者疾病風(fēng)險(xiǎn)度。方法：Invader化學(xué)檢測(cè)法。結(jié)果：110例患者中，HPV陽(yáng)性者37例，檢出率為34%，病理檢測(cè)異常21例患者中，HPV陽(yáng)性21例。關(guān)鍵詞：Invader化學(xué)檢測(cè)法高危型HPV宮頸病變Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.03.563【中圖分類號(hào)】【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1671-8801(2014)03

2、-0363-01人乳頭瘤病毒(HPV)可以通過(guò)多種途徑感染生殖道，從而導(dǎo)致尖銳濕疣以及宮頸病變，甚至可能引起宮頸癌的發(fā)生。因此有針對(duì)性地進(jìn)行HPV分型檢測(cè)對(duì)于宮頸癌的早期診斷和治療具有重要意義。為了解我院婦科門診患者HPV感染情況以及其基因型特點(diǎn)，對(duì)110例女性患者的宮領(lǐng)脫落細(xì)胞進(jìn)行了Invader化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)HPV基因分型，結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1材料。檢測(cè)標(biāo)本來(lái)自呼倫貝爾市人民醫(yī)院2013年4月?2014年2月的婦科門診就診并行細(xì)胞學(xué)TCT患者樣本共110例。年齡在20?65歲之間

3、。以專用宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采樣。所用試劑和儀器均由北京英碩力金柏科技有限公司提供。1.2轉(zhuǎn)移和離心標(biāo)本。水平搖勻新柏氏標(biāo)本瓶，使細(xì)胞沉淀混勻，轉(zhuǎn)移2ml樣本加入深孔板。1.32500rpm離心lOmin，棄去上清，保留板底的細(xì)胞塊。1.4加入混合裂解液(LysisBuffer)和蛋白酶K(ProteinaseK)400P1放入恒溫混勻儀中，37°C孵育15min,轉(zhuǎn)速lOOOrpm。1.5提取DNAO加入200ul結(jié)合液(BindingBuffer)25°C混勻3min,轉(zhuǎn)速lOOOrpm,

4、將深孔板在磁鐵上靜置5min,用抽吸器棄去上清。1.6清洗。加入400ul清洗液(washbuffer)25°C混勻5min，轉(zhuǎn)速lOOOrmp，在磁鐵上靜置5min，棄去上清，在用70%酒精清洗兩次，400ul靜置磁鐵上lmin,棄去上清，風(fēng)干酒精在磁鐵上放置5min(目測(cè)是否干燥)。1.7DNA洗提。加入120ullOmMtris液體到孔鹿，25°C，轉(zhuǎn)速lOOOrmp，混合6min(震蕩2min，間歇2min);轉(zhuǎn)移DNA到DNA保存盤。1.8熱循環(huán)儀反應(yīng)。將質(zhì)控和樣本轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板上各10

5、ul,加20ul礦物油進(jìn)行覆蓋，放入熱循環(huán)儀上，運(yùn)行C63程序，待程序進(jìn)行到63°C時(shí)，加入反應(yīng)混合液10ul,四小時(shí)后，取出離心500rmp，然后放入熒光閱讀儀中進(jìn)行讀數(shù)。1.9結(jié)果判讀：該檢測(cè)方法使用專利的Invader化學(xué)檢測(cè)法，它是一種檢測(cè)特定核酸序列的信號(hào)放大方法。此方法使用了兩種等溫反應(yīng)：結(jié)合目標(biāo)DNA序列上的初級(jí)反應(yīng)與產(chǎn)生熒光信號(hào)的次級(jí)反應(yīng)。在初級(jí)反應(yīng)中，兩種特定序列的寡核苷酸與DNA的目標(biāo)序列結(jié)合。當(dāng)這些寡核苷酸在目標(biāo)序列上至少重疊一對(duì)堿基時(shí)，就形成了一種入侵性結(jié)構(gòu)。這種入侵結(jié)構(gòu)

6、充當(dāng)了Cleavase酶的底物，能夠被Cleavase酶切割重疊位的5'端片段，使之?dāng)嚅_(kāi)。2結(jié)果2.1HPV基因分型結(jié)果。110例患者中，HPV陽(yáng)性者37例，檢出率為34%，病理檢測(cè)異常21例患者中，HPV陽(yáng)性21例。2.2HPV各基因型年齡分布。110例女性HPV感染在20?30歲、31?40歲、41?50歲、51?60歲、＞60歲年齡區(qū)間HPV的感染率分別為35.6%、26.8%、18.3%、8.5%和7.7%。可見(jiàn)HPV感染高峰在20?50歲這個(gè)年齡段。但HPV感染者的年齡差異無(wú)顯著性。提

7、示女性生殖道HPV感染普遍存在于性活躍人群中。3討論本試驗(yàn)共檢出14種高危型HPV亞型，HPV感染年齡大部分在性活躍期，35歲以上患者以高危型HPV感染為主，110例中，25例子宮頸癌的患者，100%檢出高危型HPV，進(jìn)一步證實(shí)了高危型HPV感染在子宮頸病變發(fā)展中的重要作用。本調(diào)查顯示，高危型HPV感染是宮頸癌和癌前病變宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)的主要致病因子。Invader化學(xué)檢測(cè)法是采用一種檢測(cè)特定核酸序列的信號(hào)放大方法，利用兩種等溫反應(yīng)：結(jié)合目標(biāo)DNA序列上的初級(jí)反應(yīng)與產(chǎn)生熒光信號(hào)的次級(jí)反應(yīng)。

8、在初級(jí)反應(yīng)中，兩種特定序列的寡核苷酸與DNA的目標(biāo)序列結(jié)合。當(dāng)這些寡核苷酸在目標(biāo)序列上至少重疊一對(duì)堿基時(shí)，就形成了一種入侵性結(jié)構(gòu)。這種入侵結(jié)構(gòu)充當(dāng)了Cleavase酶的鹿物，能夠被Cleavase酶切割重疊位的5'端片段，使之?dāng)嚅_(kāi)。應(yīng)用Invader化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)HPV-DNA，大大提高了檢測(cè)的敏感性，特別是比單純宮頸刮片更敏感［2］，因此，應(yīng)用該方法對(duì)HPV-DNA檢測(cè)可作為宮頸疾病，特別是宮領(lǐng)癌及癌前病變等高風(fēng)險(xiǎn)人群的初篩手段，可根據(jù)HPV感染的基因型別預(yù)測(cè)受檢者疾病風(fēng)險(xiǎn)度，以決定其篩查間隔