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《毒熱平注射液對病毒感染巨噬細胞irak4表達的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、毒熱平注射液對病毒感染巨噬細胞IRAK4表達的影響作者：張艷麗，李秀萍，王寧萍，李澎濤【摘要】目的研究毒熱平注射液對流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬細胞株Ana-1表達IRAK4(IL-1receptorassociatedkinase4,IRAK4)的影響。方法用100TCID50流感病毒亞甲型鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬細胞株Ana-1后換用10μg/ml濃度含藥維持液繼續(xù)培養(yǎng)，于12h棄細胞上清液并收集細胞，提取細胞RNA和核蛋白，進行實時定量PCR反應（RT-PCR）和yD88的信號
2、傳導通路中IRAK4的表達有關?！娟P鍵詞】毒熱平；流感病毒；巨噬細胞；IRAK4 固有免疫是機體抵御病原生物侵襲的首道防線，有研究表明，機體針對病毒及其他病原生物等病原相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)的入侵所產(chǎn)生的固有免疫及適應性免疫由模式識別受體(patternrecognitionreceptors，PRR)啟動［1］。其中，TLR7可識別病毒單鏈RNA，以MyD88依賴的信號通路活化免疫細胞，在介導抗病毒免疫應答中發(fā)揮重要的作用［2］。本實驗
3、觀察毒熱平注射液對流感病毒感染后該信號通路中IRAK4信號蛋白的影響?！ ?材料 1.1細胞狗腎細胞株（MDCK）購自軍科院細胞室，由本室傳代后使用；小鼠腹腔巨噬細胞株Ana-1購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，由本室傳代后使用。 1.2病毒流感病毒亞甲型鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)，中國中醫(yī)藥研究院中醫(yī)所提供，本實驗室-76℃保存?zhèn)溆谩Ｓ诰湃正g雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，測血凝滴度為1∶512?！ ?.3藥物毒熱平注射液（DRP），由黃芩、梔子、燈盞花和豬膽粉4味藥物制成的中藥復方注射劑，棕色液體
4、，含生藥17.4mg/mL，由廣東省康美藥業(yè)有限公司開發(fā)提供?！ ?.4試劑Dulbecco'sModifiedEaglemedium培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基）和RPMI-1640培養(yǎng)基，為GBICO公司產(chǎn)品；新生牛血清：民海生物公司產(chǎn)品。生長液：含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液；維持液：不含血清而含2μg/ml胰蛋白酶的1640培養(yǎng)液；引物及相關試劑由賽百盛生物公司合成提供；RT逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；SYBRGreenPCRMasterMix試劑盒購自美國應用生物公司。一抗：P65(sc-37
5、2)，Santacruz產(chǎn)品；二抗（抗兔）（ZB-2301）購自北京中山生物技術有限公司。 2方法 2.1小鼠巨噬細胞株Ana-1的培養(yǎng)復蘇小鼠腹腔巨噬細胞Ana-1，將細胞混懸于生長液中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液，3d后傳代1次，取生長狀態(tài)良好的Ana-1細胞，消化液作用5min后，棄去消化液，加入適量生長液，吹打細胞，計數(shù)并調細胞濃度為3×106/ml，移入12孔板,每孔加細胞懸液1ml，貼壁培養(yǎng)4h后棄去未貼壁的細胞?！ ?.2藥物細胞毒性實驗（MTT比色法）待Ana-1細胞生長狀態(tài)最好時，
6、用0.02%EDTA和0.5%胰酶消化細胞，用生長液調整細胞至所需濃度，將該細胞液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至致密細胞單層。用維持液將毒熱平注射液稀釋為不同濃度，加入細胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，每個藥物稀釋濃度平行做3個復孔，同時設正常細胞對照。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，用MTT（終濃度為0.5mg/ml）比色法檢測藥物對Ana-1細胞的毒性，按Reed-Muench法計算藥物最大無毒濃度（TC0）和半數(shù)中毒濃度（TC50）?！ ?.3病毒感染性測定
7、（TCID50的測定）用無血清DMEM培養(yǎng)液對流感病毒FM1株行連續(xù)10倍遞次稀釋，將各稀釋度的病毒接種于3×105/ml的MDCK細胞中，每個稀釋度平行做6個復孔，同時設正常細胞對照。37℃吸附2h后吸棄病毒液換用維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應，并記錄病變程度和孔數(shù)，以細胞對照無明顯退變，病毒感染細胞病變率達50%及以上的細胞孔為病變孔，細胞病變率小于50%的為非病變孔，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50（mediantissuecultureinfectivedosage）。
8、流感病毒FM1的TCID50=10-4.3?！ ?.4毒熱平注射液作用于病毒感染的巨噬細胞用維持液稀釋100TCID50的流感病毒FM1株，0.5ml/孔于37℃吸附單層Ana-1細胞1.5h后，吸棄病毒液用溫浴的PBS清洗細胞2次后，換用10μg/ml的含藥維持液作為實驗藥物組，同時設有正常細胞對照組和病毒對照組，每濃度3個復孔。37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，孵育12h后
