survivin及 bcl2基因表達(dá)在胃癌細(xì)胞

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1、survivin及bcl2基因表達(dá)在胃癌細(xì)胞【摘要】目的探討胃癌細(xì)胞株MGC803對順鉑（CDDP）耐藥產(chǎn)生的有關(guān)機制。方法觀察不同濃度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)對MGC803細(xì)胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl2mRNA表達(dá)的影響，用MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率；熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期的變化；RTPCR檢測survivin、bcl2mRNA的表達(dá)。結(jié)果10mg/L的CDDP對MGC803細(xì)胞有較強的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干預(yù)24h后，其抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用逐漸消失；

2、CDDP作用于細(xì)胞48h后，細(xì)胞S期增加，G2/M期下降；MGC803細(xì)胞在1.0mg/L的CDDP作用下，survivinmRNA表達(dá)自24h后逐漸增高，bcl2mRNA表達(dá)逐漸下降(P＜0.05)。結(jié)論CDDP可干擾MGC803細(xì)胞周期，但該細(xì)胞對低濃度CDDP易于產(chǎn)生耐藥，survivinmRNA表達(dá)增高可能是MGC803細(xì)胞對CDDP產(chǎn)生耐藥原因之一?！娟P(guān)鍵詞】胃癌細(xì)胞株順鉑耐藥細(xì)胞凋亡survivinbcl2胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其死亡率居各類惡性腫瘤之首，化療作為胃癌的重要治療手段之一，其療效仍不令人滿意，原因主要與癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。為此，本實驗參照文獻(xiàn)[1

3、],將胃癌常用化療藥物順鉑（Cisplatin,CDDP）設(shè)為三個不同作用濃度，通過檢測MGC803細(xì)胞在順鉑作用過程中細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因survivin、bcl2mRNA的表達(dá)變化，探討胃癌細(xì)胞對細(xì)胞毒性藥物順鉑耐藥的產(chǎn)生及可能機制。1材料與方法1.1藥物與試劑RPMI1640培養(yǎng)液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青公司），四噻唑藍(lán)（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl2引物[2](上海生工合成)；βactin（上海瑞科公司）；二步法RTPCR試劑：

4、Taq酶、oligodT、dNTP、DEPC（Sangon公司），MNLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山東齊魯制藥廠，生理鹽水溶解，培養(yǎng)液稀釋）。1.2實驗方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代人胃低分化腺癌細(xì)胞株MGC803購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞于含青霉素100U/L，鏈霉素100mg/L，10％滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1.2.2MTT比色法測定藥物對細(xì)胞增殖的影響以5×103/孔接種MGC803細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，設(shè)3個復(fù)孔，實驗組加CDDP處理，使終濃度分別達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L

5、，對照組加生理鹽水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加150μl的DMSO，酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定570nm處的吸光值A(chǔ)570nm，并計算該濃度下的抑制率＝[(對照組A570nm-試驗組A570nm)／對照組A570nm]×100％。1.2.3熒光顯微鏡檢測各組藥物對細(xì)胞凋亡的作用MGC803細(xì)胞加CDDP處理，使終濃度分別達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，設(shè)3個復(fù)孔,收集細(xì)胞離心，棄上清，PBS洗3次，制成細(xì)胞懸液，加入終濃度均為100μg/ml的AO、EB，混勻，于顯微鏡下計數(shù)至少

6、200個細(xì)胞的凋亡比率。早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著桔紅色，呈固縮狀或破裂狀；壞死細(xì)胞核染色質(zhì)著桔紅色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)；活細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]。1.2.4流式細(xì)胞儀檢測各組藥物對細(xì)胞周期的影響MGC803細(xì)胞加CDDP處理，使終濃度達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，對照組加生理鹽水，共同作用48h,常規(guī)消化細(xì)胞，離心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每個樣品含細(xì)胞數(shù)至少1×106個，－20℃固定送檢流式細(xì)胞。1.2.5RTPCR法檢測CDDP干預(yù)前后survivin、bcl

7、2mRNA表達(dá)變化總RNA的制備：MGC803細(xì)胞接種于6孔板，試驗組加CDDP處理，使終濃度達(dá)1.0mg/L，對照組加生理鹽水，設(shè)3個復(fù)孔，采用Trizol法提取藥物干預(yù)前及干預(yù)12、24、48、72h細(xì)胞總RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄：按MMLV說明書進(jìn)行，cDNA置－20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增：反應(yīng)體系包括10×TaqBuffer5μl，25mM/LMgCl23μl，10mMDNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物:5'CAGATTTGAATCGCGGGACC