survivin及 bcl2基因表達在胃癌細胞株mgc803順鉑耐藥中的作用論文

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1、survivin及bcl2基因表達在胃癌細胞株MGC803順鉑耐藥中的作用論文【摘要】目的探討胃癌細胞株MGC803對順鉑（CDDP）耐藥產(chǎn)生的有關機制。方法觀察不同濃度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)對MGC803細胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl2mRNA表達的影響，用MTT法檢測細胞生長抑制率；熒光染色檢測細胞凋亡率；流式細胞儀測定細胞周期的變化；RTPCR檢測survivin、bcl2mRNA的表達。結果10mg/L的CDDP對MGC803細胞有較強的抑制增殖、促進凋亡

2、作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干預24h后，其抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用逐漸消失；CDDP作用于細胞48h后，細胞S期增加，G2/M期下降；MGC803細胞在1.0mg/L的CDDP作用下.freelRNA表達自24h后逐漸增高，bcl2mRNA表達逐漸下降(P＜0.05)。結論CDDP可干擾MGC803細胞周期，但該細胞對低濃度CDDP易于產(chǎn)生耐藥，survivinmRNA表達增高可能是MGC803細胞對CDDP產(chǎn)生耐藥原因之一?！娟P鍵詞】胃癌細胞株順鉑耐藥細胞凋亡survivinbcl2胃

3、癌是我國常見的惡性腫瘤，其死亡率居各類惡性腫瘤之首，化療作為胃癌的重要治療手段之一，其療效仍不令人滿意，原因主要與癌細胞耐藥有關。為此，本實驗參照文獻1,將胃癌常用化療藥物順鉑（Cisplatin,CDDP）設為三個不同作用濃度，通過檢測MGC803細胞在順鉑作用過程中細胞周期，細胞增殖、凋亡及凋亡相關基因survivin、bcl2mRNA的表達變化，探討胃癌細胞對細胞毒性藥物順鉑耐藥的產(chǎn)生及可能機制。1材料與方法1.1藥物與試劑RPMI1640培養(yǎng)液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青

4、公司），四噻唑藍（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl2引物2(上海生工合成)；βactin（上海瑞科公司）；二步法RTPCR試劑：Taq酶、oligodT、dNTP、DEPC（Sangon公司），MNLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山東齊魯制藥廠，生理鹽水溶解，培養(yǎng)液稀釋）。1.2實驗方法1.2.1細胞培養(yǎng)及傳代人胃低分化腺癌細胞株MGC803購自湘雅醫(yī)學院細胞中心。細胞于含青霉素100U/L，鏈霉素100mg/

5、L，10％滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。1.2.2MTT比色法測定藥物對細胞增殖的影響以5×103/孔接種MGC803細胞于96孔培養(yǎng)板，設3個復孔，實驗組加CDDP處理，使終濃度分別達0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L，對照組加生理鹽水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加150μl的DMSO，酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定570nm處的吸光值A570nm，并計算該濃度下的抑制率＝(對照組A570nm-試驗組A570nm)／

6、對照組A570nm×100％。1.2.3熒光顯微鏡檢測各組藥物對細胞凋亡的作用MGC803細胞加CDDP處理，使終濃度分別達0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，設3個復孔,收集細胞離心，棄上清，PBS洗3次，制成細胞懸液，加入終濃度均為100μg/ml的AO、EB，混勻，于顯微鏡下計數(shù)至少200個細胞的凋亡比率。早期凋亡細胞核染色質著綠色，呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細胞核染色質著桔紅色，呈固縮狀或破裂狀；壞死細胞核染色質著桔紅色，呈正常細胞結構；活細胞核染色質著綠色，呈

7、正常細胞結構3。1.2.4流式細胞儀檢測各組藥物對細胞周期的影響MGC803細胞加CDDP處理，使終濃度達0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，對照組加生理鹽水，共同作用48h,常規(guī)消化細胞，離心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每個樣品含細胞數(shù)至少1×106個，－20℃固定送檢流式細胞。1.2.5RTPCR法檢測CDDP干預前后survivin、bcl2mRNA表達變化總RNA的制備：MGC803細胞接種于6孔板，試驗組加CDDP處理，使終濃度達1.0mg/L，對照組加生理

8、鹽水，設3個復孔，采用Trizol法提取藥物干預前及干預12、24、48、72h細胞總RNA。RNA逆轉錄：按MMLV說明書進行，cDNA置－20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增：反應體系包括10×TaqBuffer5μl，25mM/LMgCl23μl，10mMDNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物:5'CAGATTTGAATCGCG