三七總皂苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向心肌樣細(xì)胞分

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1、三七總皂苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向心肌樣細(xì)胞分【摘要】觀察三七總皂苷（PNS）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）增殖和體外誘導(dǎo)其分化為心肌樣細(xì)胞的作用?！痉椒ā坎捎霉撬杓?xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)分離大鼠MSCs，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志；采用四甲基偶氨唑鹽（MTT）法觀察PNS對(duì)MSCs的增殖影響；采用第8代MSCs進(jìn)行體外心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化；采用相差顯微鏡、免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄含酶鏈反應(yīng)（RTPCR）鑒定心肌細(xì)胞?！窘Y(jié)果】大鼠MSCs細(xì)胞表面抗原CD44陽(yáng)性，CD34陰性；經(jīng)PNS作用后MSCs增長(zhǎng)速度比空白對(duì)照組明顯加快，體外誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，其細(xì)胞免疫組化呈結(jié)蛋白（Desmin）、肌鈣蛋白

2、(cTnI)陽(yáng)性；RTPCR顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞轉(zhuǎn)錄肌球蛋白重鏈mRNA水平增加?！窘Y(jié)論】PNS能促進(jìn)大鼠MSCs體外增殖并可誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，為細(xì)胞移植治療心肌梗死提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【關(guān)鍵詞】三七總皂苷/藥現(xiàn)象骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/病現(xiàn)象心肌梗死/中藥療法細(xì)胞培養(yǎng)心肌梗死后，如何促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生是心血管病學(xué)家面臨的一個(gè)難題。人們一直試圖尋找一種細(xì)胞移植材料以修復(fù)壞死心肌、改善心臟功能。近年來(lái)，干細(xì)胞的研究為人們提供了新的希望。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（mesemchymalstemcells,MSCs）是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一類干細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等分化的能力［1］，并且

3、在體外易于分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，這些特性使MSCs成為在細(xì)胞治療中有效發(fā)揮作用的理想細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外多用5氮胞苷（5azacytidine，5aza）來(lái)誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞，我們通過(guò)廣泛篩選，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）可作為MSCs分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，為心肌損傷的干細(xì)胞移植治療提供一種理想的細(xì)胞材料?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純種7周齡SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量190g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：0004979。1.1.2主要試劑與儀器IMDM（IscovesmodifiedDul

4、berccosmedium）培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；特級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)于Hyclone公司；5氮胞苷購(gòu)于Sigma公司；PNS（批號(hào)：0870-200303）購(gòu)于廣州市藥檢所（純度99％）；Percoll梯度分離液購(gòu)于Pharmacia公司；熒光標(biāo)記抗大鼠抗體CD34FITC、CD44FITC和小鼠抗人結(jié)蛋白抗體（Desmin）單抗、小鼠抗人肌鈣蛋白I（cTnI）單抗購(gòu)于SantaCruz公司；鏈霉親含素-生物素復(fù)合物（SABC）試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購(gòu)于武漢博士德公司；Trizol為Gibco公司產(chǎn)品；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成

5、；AccessRTPCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡（日本，OLYMPUS）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)力高公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMANCOULTER）；PCR基因擴(kuò)增儀（美國(guó)PE9600）。1.2方法1.2.1MSCs的分離與培養(yǎng)參照DM培養(yǎng)液沖出骨髓，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液，并移入離心管中，1000r/min離心10min；棄上清及脂肪層，收集沉淀物用完全培養(yǎng)基（含IMDM、體積分?jǐn)?shù)為10％FBS、100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素）充分混勻，加入含1.073g/mL的Percoll分離液的離心管內(nèi)，1500r/min離心20min；重復(fù)上一操作，收集中間云霧狀

6、的單核細(xì)胞層，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，用完全培養(yǎng)基接種于25mL培養(yǎng)瓶中，并標(biāo)記為P"1，置37℃含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第4天進(jìn)行首次換液。在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。1.2.2MSCs的傳代及純化參照Pittenger［3］的方法并加以改進(jìn)：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖近整個(gè)培養(yǎng)瓶的底面時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞后，用培養(yǎng)液中止消化并反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1：3傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為P2，以后每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，直至貼壁細(xì)胞彼此融合鋪滿瓶底時(shí)，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳至第8代。1.2.3MSCs的鑒定取第3代MSCs，胰酶消化后，加入熒光標(biāo)記的抗CD34、CD

7、44抗體，4℃孵育30min，以多聚甲醛固定，采用FACScan流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞表面抗原CD34和CD44。1.2.4PNS對(duì)MSCs增殖的影響取生長(zhǎng)良好的第4代MSCs，胰酶消化后吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至1×104/mL，加入96孔板，每孔200μL，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下以誘導(dǎo)培養(yǎng)液孵育24h后，去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度含PNS為50、100、15