流感病毒包裝表達(dá)之外源基因特性概述

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1、流感病毒包裝表達(dá)之外源基因特性概述第一章引言1.1禽流感病毒概述禽流感病毒，是單股分節(jié)段負(fù)鏈RNA(SS-RNA)病毒(Perdueetal.，1997),屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒。從水禽中可以分離到(Fouchieretal.,2005;S8)和NA亞型（N10和Nil)(Tongetal2013)。禽流感病毒可分為三種，高致病力、低致病力和非致病力禽流感病毒(Organization，2000)。高致病性禽流感(HighlypathogenicAvianinfluenza，HPAI)是由H5和H7亞毒株引起的疾病，傳染性強(qiáng)，病死率高，被

2、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病?？梢鸺仪萑硇試?yán)重的病理損傷，致死率達(dá)75%以上。由于病毒傳播具有受體特異性的限制，絕大多數(shù)禽流感病毒不會(huì)感染人類，但是通過病毒基因的變異，禽流感病毒能夠在不同宿主間傳播。1997年，在香港地區(qū)，H5N1高致病性禽流感病毒導(dǎo)致了多人感染及死亡，第一次證明了高致病性的禽流感可以直接感染人類。2003年底，亞洲許多國家暴發(fā)了H5N1高致病性禽流感，引起多人感染及死亡。目前我國正在流行H7N9禽流感，病毒基因來自東亞地區(qū)野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配，其內(nèi)部基因來自于H9N2禽流感病毒。

3、根據(jù)農(nóng)業(yè)部辦公廳發(fā)布的《全國家禽H7N9流感根除計(jì)劃(征求意見稿)》，從2013年我國出現(xiàn)首例人感染H7N9禽流感病例至2014年2月18日，已累計(jì)感染病例347例，死亡109例。禽流感病毒通過抗原漂移和快速重組來逃避免疫監(jiān)視（SuiJ.，2009)，導(dǎo)致禽流感危害嚴(yán)重，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也一定程度上威脅了人類的健康。1.2禽流感病毒結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)通過電鏡觀察，禽流感病毒大多數(shù)呈球形。AIV粒子結(jié)構(gòu)（圖1-1),分為三層，最外層為囊膜，來自宿主細(xì)胞的脂膜。囊膜下有形態(tài)不一的纖突，每個(gè)病毒粒子大約有500個(gè)，其中呈三聚體棒狀結(jié)構(gòu)的血凝素（

4、HA)占90%，其余的是神經(jīng)氨酸酶（NA)呈四聚體蘑恭狀（Murphyetal.，1999)。囊膜糖蛋白M2嵌合在囊膜內(nèi)，呈四聚體。囊膜下主要為結(jié)構(gòu)蛋白Ml，形成球形蛋白殼，包圍流感病毒的8個(gè)單股負(fù)鏈的RNA分子。里層即裹在蛋白殼內(nèi)的為核衣殼，它含核蛋白(NP)，三種多聚酶蛋白(PB1、PB2、PA)和病毒的單鏈RNA(Lambetal.，1993)。禽流感病毒對(duì)高溫、紫外線敏感(FranklinRM,1959),動(dòng)物的排泄物如襄便和鼻腔分泌物對(duì)病毒有保護(hù)作用，在4X：傳染性可以保持30?35天CBeardCadin-Darbycaninekidney

5、(MDCK)細(xì)胞系HA2，由上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。pIRES-Renilla質(zhì)粒、PCAGGS-optiE(徐大偉etal.，2012a)、PCAGGS-E(徐大偉etal.,2012b)、441-HA-PBD質(zhì)粒、HlNl流感病毒A/PuertoRico/8/34反向遺傳系統(tǒng)質(zhì)粒，由上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。441-opti-HA質(zhì)粒為英茂盛業(yè)公司合成。OPTIPRO?SFM(SerumFreeMedium,SFM)培養(yǎng)液購自Gibico公司；瓊脂糖購自BIOix和超純水購自東盛生物；氯仿購自上海實(shí)

6、驗(yàn)試劑公司；DAPI染色液、RIPA裂解液（中）購自威奧生物；預(yù)染蛋白Maker購自麥生物公司；抗勞光萍滅封片液購自碧云天公司。OPTI-MEM購自Invitrogen公司；TPCK-tiypsin購自Sigma公司；去內(nèi)毒素小量抽提質(zhì)粒試劑盒購自O(shè)MEGA公司；PficDNAPolymerase>LipofectamineTM2000、限制性內(nèi)切酶BspQl、T4DNA連接酶購自NEB公司；DNA純化回收試劑盒和小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；異丙醇、無水乙醇、DEPC水購自生工生物；MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑（RRI)、DL20

7、00Marker、TrizolRNA提取液、lOmMdNTP、XhoK、Mel購自TaKaRa公司；..2.2方法首先在超凈臺(tái)內(nèi)無菌操作，取菌液凍存管置于冰上，用挑菌環(huán)沾取少量與2ml的Amp培養(yǎng)液內(nèi)，活化菌液，然后按照以下步驟提取PBD-PR8-HA質(zhì)粒：12000rpm離心Imin,棄去上清，加入250ul的BufferS1,反復(fù)吹打裂解菌液，再加入250ul的BufferS2,輕輕混合均勻，待溶液透亮后，加入350ul的BufferS3,混合至有白色絮狀物，12000rpm離心lOmin，小心吸取上清至有制備管的2mlEP管中，12000rpm離

8、心Imin，棄去濾液，加入500ul的BufferDCK-HA2細(xì)胞上的傳代培養(yǎng).......