wistar大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)、鑒定和標記

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1、Wistar大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)、鑒定和標記趙科研柳克祥侯明曉孫江濱吳慧穎李博【摘要】　　目的建立SCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進行鑒定、標記。方法采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學特征；流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達率；電鏡檢查第3代MSCs超微結構。DAPI標記MSCs為下一步進行體內(nèi)細胞移植示蹤。結果原代培養(yǎng)的MSCs于6～8h后貼壁，6d左右形成集落，14d左右可達到80%～90%融合。第3代細胞表面標記物

2、CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6%，78.2%，0.0%，0.3%。超微結構清晰，可見細胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)和高爾基復合體，細胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標記MSCs細胞核，呈藍色熒光。結論采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標記MSCs?！娟P鍵詞】細胞培養(yǎng)；間充質干細胞；種子細胞；示蹤劑【Abstract】ObjectiveToestablishamethodforisolat

3、ionandcultureofbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)fromethodsMSCsthebonemarroethod.ThemorphologyofMSCsicroscope.TheexpressionofCD29,CD44,CD34andCD45ofthethirdgenerationcellsetry.Electronmicroscopicfeaturesaryculture,MSCsadheredtoplasticsurfaceoftheculturedish.

4、　About6dlater,thecellsproliferatedincolonies.PrimaryMSCsreached80%～90%ofconfluencein14dapproximately.ThepositiveratesofCD29,CD44,CD34,andCD45inMSCsatthirdgenerationicroscopeMSCshadplentifulcytoplasmitochondriaroughendoplasmicreticulaandGolgiplexes.Theirnucle

5、iicrovillionthesurface.AlloftheMSCsafterlabelingbyDAPIshoalstemcellscanbesuccessfullyisolatedandcultivatedbyadherentmethod.AndhigherpurityMSCscanbepickedupaftercultureexpansionatP3.DAPIcanbeaneffectivetraceragenttolabelMSCs.【Keyalstemcells;Seedcells;Tracerag

6、ent　　骨髓間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，可以向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、干細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞以及心肌細胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強，而且在異體移植中排斥反應小，被認為是組織工程和基因工程的理想種子細胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標記的方法，以獲得穩(wěn)定的

7、培養(yǎng)體系，為應用組織工程技術提供大量的種子細胞。　　1材料與方法　　1.1動物　　清潔級雄性EM培養(yǎng)基(Gibco公司),特級胎牛血清(Gibco公司),胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29AlexaFluor(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司),小鼠抗大鼠CD44PE(SantaCruz公司),小鼠抗大鼠CD34FITC(SantaCruz公司),46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲存液(Sigma公司)?！　?.3分離和培養(yǎng)

8、　　EM沖洗骨髓腔，取混懸液，1000r/min離心10min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細胞接種在100ml培養(yǎng)瓶中，5%CO2,37℃下培養(yǎng)24～48h，換液，去除未貼壁細胞，2～3d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細胞融合情況，細胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計數(shù)儀計數(shù)細胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細胞?！　?.4透射電鏡樣品制備　　將培養(yǎng)3代10c