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1、人參皂甙Rg3對(duì)荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠黏膜免疫力影響作者：吳皓 林洪生 裴迎霞 祁鑫 呂誠(chéng) 趙林華 肖誠(chéng) 呂愛(ài)平【摘要】 ?。勰康模萦^(guān)察人參皂甙Rg3對(duì)腫瘤化療腸道黏膜損傷的治療作用及其黏膜免疫機(jī)制。［方法］運(yùn)用給小鼠原位接種C-26結(jié)腸癌并重復(fù)灌胃環(huán)磷酰胺建立腫瘤化療腸道黏膜損傷的模型，觀(guān)察人參皂甙Rg3對(duì)瘤重、抑瘤率及PP結(jié)面積影響，分離腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，固有層淋巴細(xì)胞及PP結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞，用免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀分析黏膜免疫各部位T淋巴細(xì)胞亞群的變化。［結(jié)果］環(huán)磷酰胺組瘤重顯著降低，抑瘤率約為37.6%，而環(huán)磷酰胺加Rg3組瘤重與環(huán)磷酰胺組
2、比較差異無(wú)顯著性。荷瘤及環(huán)磷酰胺都可顯著降低PP結(jié)面積，而人參皂甙Rg3可明顯減輕環(huán)磷酰胺對(duì)PP結(jié)面積的影響(P<0.01)。人參皂甙Rg3可使荷瘤和環(huán)磷酰胺作用下顯著減少的固有層淋巴細(xì)胞中的CD4+細(xì)胞百分比顯著增加(P<0.05)，但對(duì)CD8+細(xì)胞百分比無(wú)明顯影響。［結(jié)論］荷瘤及環(huán)磷酰胺可明顯抑制腸道黏膜免疫功能，而人參皂甙Rg3能明顯改善這種黏膜免疫抑制狀態(tài)。人參皂甙Rg3對(duì)黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用是扶正中藥發(fā)揮作用的重要途徑之一?！娟P(guān)鍵詞】人參皂甙Rg3 黏膜免疫 腫瘤 環(huán)磷酰胺 小鼠 黏膜損傷（mucosalinjure,MI）是
3、腫瘤化療中常見(jiàn)的毒副反應(yīng)[1]。臨床上黏膜損傷不但會(huì)引起疼痛，嚴(yán)重地影響患者的生活質(zhì)量并降低治療效果，而且是患者并發(fā)感染的重要危險(xiǎn)因素。權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)表的報(bào)告認(rèn)為黏膜炎不僅是放化療作用于上皮干細(xì)胞引起的局限于黏膜上皮的毒性反應(yīng)，更是黏膜下的其它細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)都參加的一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[2]。臨床研究表明，扶正中藥對(duì)化療引起的胃腸道毒副作用及黏膜炎有良好的治療作用[3，4]。《靈樞·五癃津液別》云：“脾為之衛(wèi)”。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃功能旺盛是保證機(jī)體健康、抵抗外邪侵犯的重要因素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也發(fā)現(xiàn)成人黏膜有重要屏障功能，是一個(gè)強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)。目前有關(guān)化療對(duì)小腸黏膜
4、免疫系統(tǒng)的影響及中藥扶正藥治療荷瘤機(jī)體化療所致黏膜炎的黏膜免疫機(jī)制還未見(jiàn)有全面報(bào)道。本研究以環(huán)磷酰胺多次灌胃的荷瘤小鼠為模型，研究人參皂甙Rg3治療化療所致的黏膜損傷的黏膜免疫機(jī)制。1材料與方法1.1材料雌性BALB/c小鼠，3周齡，60只，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，清潔級(jí)，體重（16±2）g，許可證號(hào)：SCXK（京）2000?鄄0006。隨機(jī)分為4組:Ⅰ.假手術(shù)組，15只；Ⅱ.荷瘤模型組，15只；Ⅲ.環(huán)磷酰胺組，15只；Ⅳ.環(huán)磷酰胺加Rg3組，15只。C?鄄26結(jié)腸癌瘤株：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所韓銳研究員惠贈(zèng)。FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3
5、e，PE標(biāo)記的抗小鼠CD4，PE?鄄cy5標(biāo)記的抗小鼠CD8，eBioscience公司產(chǎn)品（購(gòu)自晶美公司）。1.2方法腫瘤細(xì)胞接種:選取生長(zhǎng)良好的C?鄄26結(jié)腸癌瘤組織，按腫瘤（g）：生理鹽水（ml）為1：3比例勻漿，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×107/ml。荷瘤模型組、環(huán)磷酰胺組及環(huán)磷酰胺加Rg3組，在麻醉狀態(tài)下打開(kāi)腹腔，將20μlC?鄄26腫瘤細(xì)胞（共1×106）接種于盲腸漿膜下，縫合腹壁，造成荷瘤C?鄄26結(jié)腸癌模型。假手術(shù)組：同樣條件下開(kāi)腹，盲腸漿膜下注射20ml生理鹽水。灌胃及施灸方法：假手術(shù)組，從接種后至處死為止，每日0.9%生理鹽水200μl灌
6、胃。環(huán)磷酰胺組從接種后第1~12d，給予0.9%生理鹽水200μl灌胃，第13~17d，每日給予環(huán)磷酰胺200ml（總劑量為5μg）灌胃。環(huán)磷酰胺加Rg3組從手術(shù)后第2d起到17d止,每日給予人參皂甙Rg3200μl(每日200mg/kg)灌胃，第13~17d，每日給予環(huán)磷酰胺200μl（總劑量為5μg）灌胃。1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法瘤重及抑瘤率的計(jì)算：打開(kāi)腹腔，剝離腫瘤，稱(chēng)重，并計(jì)算環(huán)磷酰胺的抑瘤率。抑瘤率=（實(shí)驗(yàn)組的平均瘤重/對(duì)照組的平均瘤重）×100%記錄PP結(jié)面積：取出全部小腸。用含5%NCS的D?鄄Hank’s液沖洗腸腔。肉眼觀(guān)察PP結(jié)，記錄
7、個(gè)數(shù)和面積，并剪下PP結(jié)。小腸黏膜淋巴細(xì)胞的分離：用細(xì)塑料繩穿過(guò)腸腔，翻轉(zhuǎn)小腸使黏膜面向外。翻轉(zhuǎn)后的小腸置于37℃預(yù)熱消化液中。放入恒溫箱中于37℃孵育40min，取出離心管充分振蕩，用300目的尼龍網(wǎng)濾過(guò)消化液。消化液過(guò)濾后離心1min（1000r/min），去除上清，加入含5%NCS的1640培養(yǎng)液及100%percoll，充分混勻后成為40%細(xì)胞?鄄percoll混懸液，用巴式毛細(xì)吸管在試管底部輕輕加入1ml70%percoll，使兩層液體間形成清晰的界面，制成percoll梯度分離液。離心600g，25℃，20min。收到40%與70%pe
8、rcoll界面間的細(xì)胞，用含5%NCS的D?鄄Hank’s液洗3次，即為IEL。去除IEL后,將經(jīng)過(guò)消化液消化振蕩后的小腸
