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1、亞洲牛帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)延伸因子：申萍香，吳璇，黃江，胡旭初，余新炳，包懷恩，廖興江【摘要】目的對(duì)亞洲牛帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)延伸因子-1(elongationfactor1,EF-1)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和免疫學(xué)初步研究。方法將亞洲牛帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)EF-1克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中用異丙硫代-β-D半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行鑒定，用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱進(jìn)行純化，用蛋白印跡法(ethodsByscreeningthefulllengthcDNAplasmidlibrary,the
2、codingregionofEF-1plifiedatography,anditsimmunogenicityedigestionandDNAsequencingconfirmedthattherebinantexpressionplasmidmunizingtheserumofsmunogenicity.ConclusionAnovelgenecodingEF-1ofTaeniasaginataasiaticaportanceforfurtherresearchonthebiologicalfunctionofthegene. KEYBI公司；DNA凝膠回收試劑
3、盒、質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、DAB(3，3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德有限公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；TMB顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；SDS、丙烯酰胺、亞甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸胺、尿素等試劑均購(gòu)自上海申友生物科技公司?！ ?.1.4引物合成和DNA測(cè)序 基因擴(kuò)增引物和重組質(zhì)粒DNA測(cè)序由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司合成?！ ?.2方法 1.2.1EF-1基因的識(shí)別 將獲得的亞洲牛帶絳蟲(chóng)unigene進(jìn)行Blastx分析，獲得編碼亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)延伸因子-1基因文庫(kù)質(zhì)粒
4、編號(hào)為T(mén).aHC23-E9，GenBank登錄號(hào)為EF420501的同源基因；并通過(guò)瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASY,ca.expasy.org/)預(yù)測(cè)其理化特性。1.2.2EF-1基因的擴(kuò)增根據(jù)已獲得的EF-1編碼序列，利用DNAClub和PCRdesign設(shè)計(jì)引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，帶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以亞洲牛帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中EF-1基因的克隆質(zhì)粒為模板，94℃預(yù)變性5min后，熱循環(huán)參數(shù)為
5、94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物10g/L瓊脂糖凝膠電泳回收?！ ?.2.3重組原核表達(dá)質(zhì)粒［pET-28a(+)-EF-1］的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定?！ ?.2.4重組蛋白的表達(dá) 將確定能表達(dá)重組蛋白的單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后1∶100轉(zhuǎn)接到1000mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600約為0.6時(shí)加入
6、IPTG至終濃度為1mmol/L，28℃、250r/min進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)4h后離心收菌，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。 1.2.5菌體的裂解、重組蛋白可溶性判斷及待純化融合蛋白上清的制備 取單菌落接種于1000mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，28℃震蕩培養(yǎng)4h，4℃離心(6000g×10min)，收集菌液，按文獻(xiàn)［5］的方法，每克菌(濕重)加入3mL裂解緩沖液，重懸細(xì)菌沉淀，裂解液冰上超聲破碎(160in)，4℃13000r/min離心20min，收集上清和沉淀，分別取上清10μL加
7、入4×SDS上樣緩沖液和沉淀微量加1×SDS上樣緩沖液，煮沸5-10min后行150g/LSDS-PAGE判斷重組蛋白的可溶性?！ ?.2.7arker條帶剪下，PVDF膜轉(zhuǎn)入感染亞洲牛帶絳蟲(chóng)豬和患者血清中(1∶100稀釋)，室溫孵育2h，PBS洗滌3次，每次5min。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬和抗人IgG(1∶2000稀釋)，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，每次5min，DAB顯色至出現(xiàn)目的條帶，超純水終止反應(yīng)［6］?！ ?結(jié)果 2.1生物信息學(xué)分析 該基因與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EF-1基因(登錄號(hào)為AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性達(dá)87%，相
