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《甘藍型油菜gpat6基因的克隆與功能分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、甘藍型油菜GPAT6基因的克隆與功能分析第一章文獻綜述1.1植物GPAT酶GPAT是三酰甘油生物合成的限速酶[1],主要負責(zé)將?；D(zhuǎn)移到G3P的sn-1位置上形成溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid，LPA)。定位于質(zhì)體的GPAT酶以acyl-ACP為?；w，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的GPAT酶以acyl-CoA為酷基供體[2]。溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶將acyl-CoA的醜基轉(zhuǎn)移到LPA的sn-2位上形成粦脂酸(Phosphatidicacid,PA)[5]。PA在磷脂酸憐酸酶的催化下，去磷酸化
2、形成二酰甘油(Diacylglycerol,DAG),DAG在二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerolacyltransferase，DGAT)的催化作用下，結(jié)合第3個醜基，形成三醜甘油(Triacylglycerol，TAG)[6]。三醜甘油是植物種子中含量最多的脂類。目前有關(guān)植物GPAT基因的研究已在多種植物中展開。1.2植物基因家族成員GPAT基因已從多種植物如擬南芥(、豌sativum)南瓜（Q/cesculentum)岡、藍莉(Echiumvulgare)、油桐(Jatlatifolium
3、)⑴中被克隆。目前在擬南芥中己經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因家族有10個成員，分別為ATS、AtGPATl、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGR4T6、AtGPAT7、AtGPATS和不同成員的定位大不相同，定位于質(zhì)體[8]、AtGPAn/2/3定位于線粒體[12]、GE47V/5/d/7/8/9定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。..1.3醜基轉(zhuǎn)移sn-2位特異性隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)GPAT酶除了具有將酷基轉(zhuǎn)移到G3P的sn-l號位上形成LPA的功能之外[二3〖g2324]，還能將酰基轉(zhuǎn)移到G3P的sn-
4、2位置上，產(chǎn)生sn-2LPA或sn-2-單醜甘油（sn-2monoacylglycerolsn-2MAG)8]。目前，具有這一特性的GPAT酶只在陸生植物中被發(fā)現(xiàn)。因此，研究者們將這一類酶命名為陸生植物特異性GPATs。為了區(qū)分具有這一特性的GPAT酶，生化分子生物學(xué)國際聯(lián)合酶學(xué)命名委員會為其給出了一個新的EC編號EC2.3.1.198。體外酶活性實驗表明AtGPATl、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGPAT6、AtGPAT7和AtGPAT8都具有sn-2酷基轉(zhuǎn)移活性。此外，AtGPAT4、AtGPA
5、T6和AtGPAT8還具有磷酸酶活性，因此其摧化主要是sn-2MAG，而非sn-2LPA。AtGPAT2和AtGPAT3是否有sn-2?；D(zhuǎn)移活性尚未經(jīng)實驗證實，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型和活性位點序列比對、預(yù)測結(jié)構(gòu)表明AtGPAT2和AtGPAT3可能具有sn-2?；D(zhuǎn)移特性。由于sn-1單酷甘油的熱力學(xué)穩(wěn)定性比sn-2單酰甘油高，因此，植物體內(nèi)sn-2單酰甘油不到sn-1單酰甘油的1/3。至于sn-2單醜甘油能否賦予聚酯獨特的性能優(yōu)勢？或者sn-2單體能為聚酷提供特異的識別信號使其進入特定的生物途徑或聚集場所？或者
6、僅僅是因為其與sn-1酰基化合物結(jié)構(gòu)不同而進入不同的代謝途徑？這些問題都有待于進一步通過生物學(xué)研究來解答。第二章基因的克隆與序列分析2.1材料和方法試劑：西班牙Bioerase購自北京全式金生物有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及DNAse購于索萊寶生物公司；PMD19-TTA克隆載體購自大連TaKaRa公司；在華大基因合成PCR引物；其他常用試劑購自上海國藥，均為分析純。儀器：eppendorfPCR儀、eppendorf移液器、eppendor搞速離心機、-80°C超低溫冰箱、pH
7、計、電泳儀、分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)、烘箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋等。2.2結(jié)果與分析將RT-PCR擴增基因產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示引物對BnGPAT6F_129367.3)基因的相似度分別為84.7%和85.3%，BnGPAT6-1與BnGPA丁6-2之間的相似度達到89.1%。用MEGA5.0對白菜CBra005137.Bra017137)、甘藍和甘藍型油菜⑶o基因。(2)基因在花中大量表達，在未成熟的種子中表達量呈倒V形；表達量在干旱、6-BA和高鹽脅迫下均發(fā)生變化，受ABA抑制，不
8、受水漬的影響。(3)基因在酵母中表達，改變了酵母的脂肪酸組分。(4)基因在擬南芥種子中特異表達，改變了擬南芥中子各脂肪酸成分的比例，同時降低了種子含油量。............
