脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響

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1、脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響【摘要】目的：探討脈沖電磁場（PEMFs)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rMSCs）的影響.方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，對其進行1Hz和15Hz的PEMFs刺激，MTT法測定細胞增殖水平，檢測堿性磷酸酶活性，進行四環(huán)素熒光染色和鈣結(jié)節(jié)染色.結(jié)果：rMSCs經(jīng)PEMFs刺激后，各實驗組細胞增殖水平均有不同程度提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中1Hz，0.4mT組改變最為明顯（3d，0.323±0.051；5d，0.714±0.058），對照組（3d，0.246±0.044；5d，0.487±

2、0.064），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；堿性磷酸酶檢測實驗組水平升高（5d，0.348±0.032；15d，2.339±0.034），對照組（5d，0.205±0.026；15d，0.533±0.013），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），四環(huán)素熒光染色和鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果均呈陽性.結(jié)論：rMSCs經(jīng)PEMFs刺激后，能促進體外培養(yǎng)rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁場參數(shù)對實驗結(jié)果有影響.【關(guān)鍵詞】脈沖電磁場；骨髓間充質(zhì)干細胞；增殖；成骨細胞　　0引言　　骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于骨髓基質(zhì)系

3、統(tǒng)中，具有自我更新能力和多向分化潛能，免疫原性弱［1-3］.脈沖電磁場（pulsedelectromagicfields，PEMFs)能夠促進活細胞增殖及分化，刺激骨局部因子的產(chǎn)生，改善骨密度和生物力學特性［4］，用于骨折延遲愈合、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病［5］.近年來，國內(nèi)學者在這方面開始了大量研究工作，認為MSCs經(jīng)12Hz，1.1mT的PEMFs合理刺激后，細胞增殖加速，符合成骨細胞的形態(tài)特征和生物學特性［6］.利用恒磁場作用于骨組織中細胞，發(fā)現(xiàn)恒磁場處理可以促進MSCs向成骨方向分化［7］.本實驗通過觀察rMSCs在低頻率PEMFs的作用下增殖水平

4、變化和細胞分化情況，以了解不同參數(shù)的PEMFs對rMSCs產(chǎn)生的影響.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD仔鼠，12～15d，體質(zhì)量30～35g，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.骨愈合刺激儀（第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程系研制，ZL.0224739.4），治療頻率為15Hz和1Hz.低糖DMEM（美國Hyclone公司）；胎牛血清（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；胰蛋白酶，茜素紅S（美國Sigma公司）；鹽酸四環(huán)素膠囊（西安利君制藥股份有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1rMSC的體外分離培養(yǎng)　　斷頸處死大

5、鼠，無菌條件下取其股骨和肱骨.在PBS中將骨剪成1～2mm3的小塊，100目篩網(wǎng)過濾后移入離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，重懸浮于4mL低糖DMEM中.72h后換液.　　1.2.2rMSCs生物學特性鑒定　　進行PAS過碘酸雪夫氏染色、油紅O染色和堿性磷酸酶（ALP）染色.　　1.2.3rMSCs生長曲線的繪制　　將原代細胞以5×106cells/孔接種在24孔板上，第4日開始，每日消化3個孔，分別計數(shù)，求平均值繪制生長曲線.將第3代細胞以1×104cells/孔接種在24孔板上，第2日開始以同上方法繪制生長曲線.　　1.2.4刺激方法　　P

6、EMFs發(fā)生儀頻率：15Hz，1Hz；磁感應(yīng)強度：0～0.8mT可調(diào)；線圈直徑：200mm.調(diào)整兩線圈距離至100mm.將線圈放置在孵箱中，刺激時將細胞放置在兩線圈中間位置.調(diào)整需要的強度和頻率，刺激結(jié)束后，將對照組放在同樣位置相同時間.刺激時間為每次3h，1次/d.　　1.2.5MTT法檢測　　細胞增殖將rMSCs以1×104cells/mL接種于7個96孔板中，每板接種32孔.刺激方式為：T0組(對照組)；T1組(15Hz，0.2mT)；T2組(15Hz，0.4mT)；T3組(15Hz，0.8mT)；T4組(1Hz，0.2mT)；T5組(1Hz，0.4mT

7、)；T6組(1Hz，0.8mT)，連續(xù)作用5d.接種第2日開始PEMFs作用.第3日每板選擇16孔，加MTT（5g/L）20μL，37℃孵育4h，棄上清，加入DMSO150μL，振蕩10min，測定490nm波長時各孔的吸光度A值.第5日對其余孔做同樣檢測.　　1.2.6ALP活性檢測　　將rMSCs以每孔1×104cells/mL接種于6個24孔板中，每板接種8孔，分為2組，每組3個板.刺激方式為：T0組(對照組)，T1組(1Hz，0.4mT).接種第2日開始PEMFs刺激，連續(xù)刺激15d.第3日選兩個板，測定ALP活性.第5日和第15日各檢測2個板.　　1

8、.2.7四環(huán)素熒光標記　　將rMSCs