酒精對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響研究

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1、cultivation，exact，cellmodelcanprovideanidealexperimentalstudyofbonetissueengineeringforwardthe．Keywords：bonemarrowmesenchymalstemcells；osteoblast；cellculture4引言特發(fā)性股骨頭缺血性壞死(IFHN)主要包括激素性和酒精性的股骨頭壞死。IF}玎N是一種常見致殘性疾病，發(fā)病率較高，近年來呈逐漸上升趨勢。如早期不能得到及時有效的治療，80％以上的患者將最終導(dǎo)致壞死性骨關(guān)節(jié)病，甚至致殘。股骨頭缺血性壞死仍是醫(yī)學(xué)界的一大難題，

2、了解IFHN的發(fā)病機(jī)制，對探索該病有效的預(yù)防、早期診斷和治療方法有重要的臨床意義。酒精性股骨頭缺血性壞死致殘率極高，常累及中青年，呈進(jìn)展性和致殘性發(fā)展，如早期不能得到及時有效的治療，80％以上的患者將在4年內(nèi)發(fā)生股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙變窄，最終導(dǎo)致壞死性骨關(guān)節(jié)炎，病人髖關(guān)節(jié)功能障礙而致殘不得不行人工髖節(jié)置換。長期過量飲酒是股骨頭缺血壞死的高危因素。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大量飲酒發(fā)生ONFH的幾率大大增高，并和飲酒的計量存在明顯相關(guān)性，一個星期內(nèi)飲酒量小于400ml的相對危險系數(shù)為3．3、400．1000ml之間的相對危險系數(shù)為9．8、大于1000ml的相對危險系數(shù)為17．9。

3、此后我國進(jìn)行了全國多中心大樣本病例對照試驗發(fā)現(xiàn)，飲酒量與發(fā)生ONFH存在明顯相關(guān)性，其中偶爾、經(jīng)常飲酒者發(fā)生股骨頭缺血性壞死的的相對危險系數(shù)分別是3．2、13．1。每周飲酒量小于3209的相對危險系數(shù)為2．8、320—7999的為9．4、8009以上是14．8。酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制仍不清楚。長期大量飲酒可引起股骨頭髓內(nèi)成骨細(xì)胞功能發(fā)生改變，使成骨細(xì)胞凋亡，相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化。但其機(jī)制尚不清楚，國內(nèi)外類似研究報道較為匱乏。本研究采用大兔細(xì)胞體外培養(yǎng)，分析觀察充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的生長情況，運(yùn)用Percoll分離液，利用密度梯度離心法聯(lián)合差速貼

4、壁法分離、純化骨髓BMSCs并對常規(guī)培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)方法進(jìn)行對比分析，并研究觀察酒精對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡的影響。為研究骨折骨病治療的基礎(chǔ)實驗研究建立理想的細(xì)胞模型提供較好的細(xì)胞模型。正文本研究于2012．01／2012．12在廣西大學(xué)生命科學(xué)實驗中心實驗室完成。選用健康2月齡新西蘭大白兔1只，體質(zhì)量2．0．2．5kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：scxK(桂)2012．002。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定【31。l材料和方法1．1實驗儀器：潔凈工作臺蘇州安泰(SW-CJ—IFD)低速離心機(jī)上海安亭(

5、TDL．80．2B)倒置光學(xué)顯微鏡日本(OPTEC，BDS200)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱美匡](HERACELL150i)水平搖床北京六一。(WD-9405B)實驗試劑：胎牛血清(Hyclone公司，Cat．No．SI-130087．01)DMEM．高糖培養(yǎng)基(Hyelone公司，Cat．No．SH30023．01B)DⅧM．低糖培養(yǎng)基(Hyelone公司，Cat．No．SH30021．01B)DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，Cat．No．SH30023．01B)199基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone公司，Cat．No．SH30253．01B)青鏈霉素(北京碧云天公司)膠

6、原酶I型(美國sigma公司，9001—12-1．SC013001)乙醇(美國sigma公司，79—14一1．S12473701)胰蛋白酶(北京碧云天公司)D-Hanks液、TE酶中國華美公司PBS磷酸鉀緩沖液中國華美公司61．2方法1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)取用新西蘭大白兔(2．0．2．5kg)，無菌下取雙側(cè)股骨頭髓內(nèi)脂肪組織，仔細(xì)去除肉眼可見的纖維和血管組織，用PBS洗滌去除血塊。用眼科剪剪成O．5～lmm大小，加入膠原酶I(19／L)，37℃水浴振蕩(100r／min)消"f)660—90min，直至形成乳糜樣濃稠液體。將消化后的乳糜樣液體加入4mlPBS，輕輕吹打混勻，

7、將細(xì)胞運(yùn)用2501am大小尼龍網(wǎng)慮入離心管中，加入10mlFBS向離心管中沖洗細(xì)胞3次。運(yùn)用每2509／min的轉(zhuǎn)動速度離心5min，采用吸管吸出上清液，添入另外一根試管中，并注入PBSloml沖洗細(xì)胞，給予離心、除去上清液后反復(fù)此程序2次。再次運(yùn)用含20％新生牛血清DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)液10ml沖洗，重懸浮細(xì)胞，密度為2×105個／ml。用50p．1添加進(jìn)每孔2ml的培養(yǎng)液6孔板中，蓋上20mmx20mm的多聚賴氨酸清理過的消毒無菌蓋玻片。置入5％C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，37"C進(jìn)行培養(yǎng)。換液的時間由細(xì)胞貼壁情況而定。逐日在倒置顯微