豬圓環(huán)病毒ⅱ型特異性單克隆抗體的研究

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1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型特異性單克隆抗體的研究【中文】豬圓環(huán)病毒(porcinecircovirus，PCV)是近年來新發(fā)現(xiàn)畜禽類病毒之一，疑為一種潛在人獸共患病病原。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性及基因組特征，可分為無致病性Ⅰ型(PCV1)和有致病性Ⅱ型(PCV2)。其中PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原體。它與許多豬相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)，如豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病，并且這些相關(guān)聯(lián)豬的疾病，已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流

2、行，死亡率10％～30％不等。較嚴(yán)重的地區(qū)，豬場在暴發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征時(shí)，死淘率高達(dá)40％左右，其危害和造成的重大經(jīng)濟(jì)損失顯而易見，現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的重要的豬傳染病，目前還沒有有效的預(yù)防和治療措施。因此，如何防制該病和盡早檢測該病已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)面臨的新問題。傳統(tǒng)的檢測方法(電鏡法、免疫熒光技術(shù)、原位雜交法、免疫組化法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等)多適用于實(shí)驗(yàn)室檢測，無法應(yīng)用于實(shí)踐或進(jìn)行大面積的血清學(xué)調(diào)查。因此，建立一種快速、敏感、特異的檢測方法對(duì)豬場進(jìn)

3、行清群，建立健康豬群，有著重要的意義。豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，二十面體對(duì)稱，核酸為共價(jià)閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有兩個(gè)主要的開放閱讀框，即ORF1和ORF2。其中ORF1編碼病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep蛋白)，是PCV1、PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要蛋白質(zhì)。ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(Cap蛋白)，是PCV1、PCV2的主要保護(hù)性抗原，在PCV1與PCV2間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只有PCV2ORF2蛋白可以被PCV2多抗識(shí)別。本研究利用PCV2吉林株(JL01)作

4、為免疫原，PCV2ORF2原核表達(dá)蛋白作為間接ELISA包被抗原，進(jìn)行PCV2特異性單克隆抗體的篩選和制備，為建立準(zhǔn)確快速的鑒別PCV1和PCV2的診斷方法奠定基礎(chǔ)。首先采用PK-15細(xì)胞對(duì)PCV2吉林株(JL01)培養(yǎng)，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，經(jīng)PCR鑒定和蔗1密度梯度離心提純后，作為免疫原；根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV2ORF2基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，采用PCR方法從收獲的病毒液中，擴(kuò)增出大小為579bp的核苷酸片段，并克隆到表達(dá)載體pET-32a中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到陽

5、性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-ORF2。將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了ORF2基因編碼的部分結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)特異帶約為40KD。Western-Blot印跡表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被PCV2陽性血清所識(shí)別。由此說明，重組表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為間接ELISA包被抗原，進(jìn)行PCV2ORF2抗體的篩選。與此同時(shí)，將免疫原與等量佐劑混合后，采取常規(guī)免疫與體外脾臟加強(qiáng)免疫結(jié)合的方式免疫BALB／c小鼠。將純化、變性、復(fù)性等處理后的重組蛋白作為包被抗原，建立間接

6、ELISA診斷方法。按常規(guī)方法取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合和克隆，經(jīng)間接ELISA篩選，成功獲得2株抗PCV2ORF2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C4D2和E3D4，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1∶1024、1∶512，小鼠腹水效價(jià)分別為1∶204800、1∶102400。單克隆抗體特異性結(jié)果顯示，C4D2和E3D4僅與融合表達(dá)的PCV2ORF2蛋白和PCV2吉林株反應(yīng)，而與PCV1、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)不反應(yīng)，說明此2株單克隆抗體特異性好。2株單克

7、隆抗體的獲得，為建立準(zhǔn)確快速的鑒別PCV1和PCV2的診斷方法提供了有力的手段。