硫酸鈹對小鼠體外脾淋巴細(xì)胞dna損傷的劑量效應(yīng)

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1、硫酸鈹對小鼠體外脾淋巴細(xì)胞DNA損傷的劑量效應(yīng)【摘要】目的：觀察不同劑量硫酸鈹（BeSO4）在不同時相處理后引發(fā)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂損傷的劑量效應(yīng).方法：采用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)分別測定BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞體外染毒0.2,2,20,100和200μmol/L1h和2h后DNA鏈斷裂損傷情況.結(jié)果：在不同劑量硫酸鈹染毒1h后,脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)DNA鏈斷裂損傷的測定指標(biāo)在各劑量組明顯高于對照;染毒1h和2h后,細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的DNA鏈斷裂損傷，但其相同劑量組之間差異無顯著性.結(jié)論：硫酸鈹可誘發(fā)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂損傷.【關(guān)鍵詞】

2、硫酸鈹　　0引言　　鈹（Beryllium）及其化合物具有眾多優(yōu)良的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于高科技工業(yè)領(lǐng)域.國際癌癥研究中心（IARC）最新公布的對人致癌性總評價表中已將鈹及其化合物列為人類肯定致癌物［1］.已知鈹及其化合物可損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)［2-4］.因此,應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）法檢測，以判斷硫酸鈹導(dǎo)致脾淋巴細(xì)胞功能異常是否由于DNA斷裂損傷所致,對于探討鈹免疫毒性作用機(jī)制具有重要意義.　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c小鼠,雄性，體質(zhì)量(20±2)g,6～8aAldrich公司);胎牛血清(Hyclone公司);RPMI1640(Gibc

3、o公司);低熔點瓊脂糖(Sigma公司);正常熔點瓊脂糖(Sigma公司);肌氨酸鈉(Promega公司);TrisBase(NOVEN公司);碘化丙錠（PI,Sigma公司);二甲基亞砜（DMSO,北京化工廠);TritonX100(Sigma公司);甲醛(北京化工廠)；EDTA(天津化學(xué)試劑廠);全磨沙載玻片；恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠);熒光顯微鏡(CKX41,Olympus);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(BIORAD;水平式凝膠電泳槽(DYYⅢ33A型,北京六一儀器廠).　　1.2方法　　1.2.1脾淋巴細(xì)胞懸液的制備常規(guī)無菌取脾,用注射器內(nèi)芯加Hanks

4、(pH7.4,4℃)研磨,200目篩網(wǎng)過濾,用RPMI1640完全培養(yǎng)液將其稀釋成1×108個/L細(xì)胞懸液［5］.　　1.2.2細(xì)胞染毒分別取脾淋巴細(xì)胞6份于試管中,1管加完全培養(yǎng)基作陰性對照,其余5管各加入不同濃度的BeSO4溶液,使終濃度分別為0.2,2.0,20.0,100.0,200.0μmol/L,置37℃恒溫水浴振蕩器孵育1h;同樣設(shè)6管同上染毒2h后檢測.染毒完畢后用臺盼藍(lán)染色觀察染毒后的細(xì)胞存活率大于90%.　　1.2.3DNA鏈損傷的檢測參照Singh法［6］,①制片：分別取125mg低溶點瓊脂糖（LMA）和正常溶點瓊脂糖（NMA）溶于25m

5、L無Ca2+,Mg2+磷酸緩沖液（PBS）中，制備成5g/LLMA和5g/LNMA.在56℃下，將100μL5g/LNMA澆注到全磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片置4℃，10min使瓊脂糖固化.在37℃下，將50μL細(xì)胞懸液與50μL10g/L新鮮配制的LMA混勻，4℃固化；再取75mL5g/LLMA鋪至第二層瓊脂糖上，置4℃，10min固化;②裂解、解旋、中和：將載玻片浸入4℃冷裂解液（2.5mol/LNaCl;100mmol/LEDTA;10mmol/LTris）中裂解1h，電泳緩沖液中避光放置20min；25V，300mA電泳20min，TrisHCl（pH7

6、.5）中和3次，用50μL5mg/L碘化丙錠（PI）溶液染色;③分析：熒光顯微鏡下使用590nm的綠色激發(fā)光進(jìn)行觀察，數(shù)碼相機(jī)拍照，每份樣本隨機(jī)拍攝50個DNA受損細(xì)胞，將拍攝的圖像輸入計算機(jī)（圖像設(shè)置為300×400象素進(jìn)行分析），運用CASP軟件計算彗星細(xì)胞的尾長、尾矩、Olive尾矩及尾部DNA百分含量.　　　　統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析.　　2結(jié)果　　2．1染毒后DNA損傷的“彗星”形態(tài)學(xué)觀察染色后在熒光顯微鏡察20倍鏡下觀察可見,陰性對照組的淋巴細(xì)胞大小比較均一，為一圓形熒光團(tuán)，熒光強度均勻，邊緣光滑，即彗星頭部，無拖尾現(xiàn)象

7、（圖1A）.BeSO4染毒作用時,損傷細(xì)胞的DNA遷移表現(xiàn)為彗星頭部核心致密、周邊松散,呈刷狀緣樣；并且隨著BeSO4劑量的增加，彗星的尾巴加長，尾部的熒光強度增強，彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減?。▓D1B,C,D,E,F）.A：陰性對照組；B：0.2μmol/L組；C：2μmol/L組；D：20μmol/L組；E：100μmol/L組；F：200μmol/L組.　　圖1硫酸鈹致小鼠脾淋巴細(xì)胞DNA受損形態(tài)　略　　2.2染毒不同劑量DNA鏈損傷的檢測BeSO4染毒1h和2h時所致DNA鏈損傷出現(xiàn)的尾長及尾矩與對照組相比,各劑量組顯著增加(P<0.01)

8、，彗星尾部DNA百分含量隨著BeSO4