人胚肺間充質干細胞對損傷肺組織的修復作用

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1、人胚肺間充質干細胞對損傷肺組織的修復作用作者：劉偉錢東華錢明彭麗萍【摘要】目的研究人胚肺間充質干細胞(MSCs)對損傷肺組織的修復作用。方法通過動物體內(nèi)實驗和細胞體外培養(yǎng)實驗，觀察人MSCs對肺上皮細胞的生長調(diào)控。結果人胚肺MSCs能有效調(diào)控肺泡上皮的生長。結論人胚肺MSCs及其條件培養(yǎng)液可以減輕人肺上皮損傷和加速修復，從而為臨床治療COPD、病毒性肺炎造成的肺損傷提供新的生物治療方法?！娟P鍵詞】人;胚胎肺;間充質干細胞;損傷肺組織人胚肺間充質干細胞(MSCs)可在體外擴增培養(yǎng)，可傳至17代以上，其形態(tài)及生長特點不發(fā)生明顯改變，

2、處于G0/G1期的細胞多，具有典型的干細胞增殖特點，其免疫表型與骨髓來源的MSC相似〔1〕，能夠被誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞等多種組織細胞,為肺損傷的治療提出了一個新的思路。本研究通過動物體內(nèi)實驗和細胞體外培養(yǎng)實驗，觀察人胚肺MSCs對肺上皮細胞的生長調(diào)控，證實在肺臟損傷后，人胚肺MSCs及其條件培養(yǎng)液可以減輕人肺上皮損傷和加速修復，從而為臨床治療慢性阻塞性肺病(COPD)、病毒性肺炎等造成的肺損傷提供新的生物治療方法?！　?材料與方法　　1.1MSC調(diào)控肺上皮細胞生長實驗動物體內(nèi)實驗：選用無免疫排斥反應的NOD/SCID小鼠

3、并制備呼吸道上皮、肺泡上皮損傷模型。NOD/SCID小鼠經(jīng)過137銫照射300cGy。分別輸入熒光燃料標記的人胚肺MSCs、人骨髓MSCs，定期通過肺組織切片和PCR檢測外源基因，觀察細胞移植和生長情況。經(jīng)尾靜脈輸入胎肺來源的PKH26熒光染料染色的MSCs1×106和NOD/SCID鼠自身的骨髓1×107，2個月后小鼠斷頸處死，肺臟組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察PKH26熒光陽性的細胞分布。肺臟組織提取基因組DNA，PCR測定人源性特異基因Amelogenin,上游引物：5′ACCTCATCCTGGCCACCCTGC3′,下

4、游引物5′AGGCTTGAGGCCAACCATCAG3′。PCR條件是96℃變性5min,94℃變性1min,60℃退火1min,70℃延伸1min,共30個循環(huán)，最后70℃延伸10min。分別輸入兩種干細胞和條件培養(yǎng)液給肺損傷模型鼠，觀察肺上皮損傷修復速度和程度?！　?.2體外細胞培養(yǎng)實驗　　1.2.1建立人胚肺MSC滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)體系(方法同上)?！　?.2.2人胚肺MSC支持成人呼吸道上皮細胞生長的實驗　　1.2.2.1主要試劑蛋白酶型內(nèi)皮細胞生長支持物(ECGS)、表皮生長因子(EGF)、胰島素(INS)、轉鐵蛋白(

5、TF)、甲狀腺素(T3)、氫化可的松(HC)、抗角蛋白抗體、人胎盤膠原(HPC)均為Sigma產(chǎn)品，LSAB免疫組化試劑盒為Dako產(chǎn)品，MEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清FCS為Gibco產(chǎn)品，L谷胺酰胺為Merck產(chǎn)品，余為國產(chǎn)分析純。　　1.2.2.2培養(yǎng)器皿24孔板為Coring產(chǎn)品，套皿(MillicellCMΦ12mm)為Millpore產(chǎn)品，套皿用HPC按20μg/cm2涂膜置室溫18h棄去多余HPC，室溫干燥，臨用前用PBS洗滌24孔板涂膜同上?！　?.2.2.3培養(yǎng)基配制在DEMEM/F12培養(yǎng)基中加

6、入10μg/mlINS、0.4μg/mlHC、5μg/mlTF、20ng/mlT3、25ng/mlECGS、1mmol/L谷胺酰胺、100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素為無血清培養(yǎng)基。　　1.2.2.4氣管上皮細胞分離和培養(yǎng)新鮮氣管標本取自意外死亡的健康成人，由本院提供無菌條件下，用冰冷PBS沖洗縱向。切開氣管，機械剝離黏膜層，剪成23mm長小片。同上PBS沖洗置于含蛋白酶0.5mg/mlPBS中4℃過夜消化。用漩渦震蕩器劇烈震蕩消化后的黏膜碎片10余秒，吸管輕輕吹打數(shù)分鐘，加FCS至終濃度為2.5終止酶反應，1000r

7、/min離心10min，棄上清MEM洗滌細胞2次。用含5FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基配置成細胞懸液，臺盼藍拒染色檢測活細胞數(shù)，按2.5×109個活細胞/cm2加入套皿，5%CO237℃培養(yǎng)24h后換為無血清培養(yǎng)基，隔日換底層培養(yǎng)液一次。設置常規(guī)24孔板無血清培養(yǎng)為對照?！　?.2.2.5人胚肺MSCs對成人氣道平滑肌細胞生長的影響將前述獲得的人胚肺MSCs貼壁細胞用胰酶消化，收集所有貼壁細胞，1000r/min離心，洗滌2次后，計數(shù)，取10ml同時加入0.8%甲纖素，15%MCM，30%人AB血清及適量IMDM，以1×106細

8、胞加入24孔板平滑肌的培養(yǎng)基，未加入人胚肺MSC的氣道上皮細胞為對照組，放入37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，共同培養(yǎng)10～12d，40～50個細胞為1個集落，觀察氣道平滑肌的生長情況，測定人胚肺間充質干細胞對氣道平滑肌生長情況的影響(以細胞集落數(shù)計算)。　　1