川芎嗪對青霉素致癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響論文

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1、川芎嗪對青霉素致癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響論文【摘要】目的：探討川芎嗪(TMP)對青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法：使用青霉素致癇大鼠模型,采用BL-410生物機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄雙側(cè)大腦皮層癇樣放電,待癲癇樣放電穩(wěn)定后,腹腔注射TMP,待其抑制作用最明顯時,取大腦切片,觀察大腦神經(jīng)元內(nèi)NF-κBp65蛋白表達(dá)的變化。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對NF-κBp65蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，并用SPSS11.

2、5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗。結(jié)果：TMP組大腦神經(jīng)元內(nèi)NF-κBp65蛋白表達(dá)的平均光密度及陽性面積率顯著低于模型組,差異有顯著性(P0.01)。結(jié)論：TMP對青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元有重要的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】川芎嗪癲癇放電神經(jīng)元青霉素NF-κBp65癲癇是以大腦神經(jīng)細(xì)胞群反復(fù)超同步放電引起的發(fā)作性、突然性、短暫性腦功能紊亂為特征,以反復(fù)癇樣發(fā)作為表現(xiàn)的臨床征候群,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。癲癇致腦損傷已被許多動物實驗和臨床觀察

3、所證實,神經(jīng)細(xì)胞凋亡是最近發(fā)現(xiàn)的癲癇腦損傷又一途徑,雖出現(xiàn)較晚,但卻能持續(xù)存在。川芎嗪,.freelethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海馬神經(jīng)元的放電活動,TMP可明顯抑制嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體重下降［1］,大劑量TMP對缺血、缺氧性腦損傷、海馬CA1神經(jīng)元的缺血性損傷有改善或保護(hù)作用［2，3］。TMP已被廣泛應(yīng)用于心、腦血管閉塞性疾?。?］的治療。NF-κB廣泛存在于真核生物中,是一個由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。它作為信號傳導(dǎo)途徑中的樞紐,與免疫、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋

4、亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系,是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。目前,對NF-κB的研究已成為一個非常引人關(guān)注的領(lǐng)域［5］。本課題采用免疫組織化學(xué)方法、圖像分析技術(shù)檢測了TMP對青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達(dá)及平均光密度及陽性面積率的變化影響,進(jìn)一步探討TMP對青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元作用的機(jī)制。1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物SD大鼠(由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供),雌雄不拘,體重200～250g。1.1.2實驗藥品及試劑鹽酸川芎嗪注射液(批號010700

5、1),常州制藥廠生產(chǎn)；注射用青霉素鈉(批號00109306),華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。1.1.3實驗儀器BL-410生物機(jī)能實驗系統(tǒng),成都泰盟電子有限公司生產(chǎn)；江灣I-C型立體定向器,第二軍醫(yī)大學(xué)器材處生產(chǎn)。1.2方法1.2.1癲癇動物模型實驗選用健康SD大鼠,用10%烏拉坦以10ml·kg-1體重腹腔注射(ip)麻醉,將動物固定在江灣I-2C型立體定向器上,于大腦左、右兩側(cè)前鹵后3mm,矢狀縫旁開3mm行開顱手術(shù),暴露大腦皮層記錄區(qū)域(2mm×2mm),將銀球電極置于左、右兩側(cè)的記錄部位,信

6、號輸入置BL-410生物機(jī)能實驗系統(tǒng),進(jìn)行左、右兩側(cè)腦電記錄。用浸有青霉素溶液的明膠海綿(200u/mm3)置于左側(cè)大腦皮層表面,誘發(fā)大鼠大腦皮層癲癇樣放電,待癲癇放電穩(wěn)定后,移去明膠海綿,用浸有溫?zé)嵘睇}水棉球蓋住創(chuàng)口。1.2.2試驗分組及取材將實驗大鼠隨機(jī)分為3組,每組10只:①A組(對照組),麻醉開顱手術(shù)1h后取大腦;②B組(模型組),青霉素誘發(fā)癲癇1h后取大腦；③C組(TMP組),青霉素誘發(fā)癲癇放電穩(wěn)定后,再腹腔注射TMP(20mg·kg-1),待抑制作用最明顯時取大腦。1.2.3HE染

7、色常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚約4μm)及HE染色。1.2.4免疫組織化學(xué)S-P法檢測NF-κBp65蛋白相關(guān)抗原主要步驟：①組織切片5μm，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；②3%過氧化氫，37℃孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③Bcl-2采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min）.freelin；④正常羊血清37℃孵育10min以減少非特異性反應(yīng)；⑤一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；⑥生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑦鏈霉菌抗生物

8、素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑧DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)；⑨蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，人扁桃體作為NF-κBp65的陽性對照組。1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷NF-κBp65相關(guān)抗原以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對NF-κBp65蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完