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1、RNAi沉默EGFR基因?qū)β殉舶┓暖熋舾行缘挠绊懽髡撸毫诌h(yuǎn)洪吳永忠李少林郭啟帥羅茜【摘要】目的探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因?qū)β殉舶┓暖熋舾行缘脑鰪?qiáng)作用。方法構(gòu)建針對(duì)EGFR基因序列特異性短發(fā)夾狀RNA(shRNA)表達(dá)載體，應(yīng)用卵巢癌SKOV3細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、單純放療組、基因放療組，采用6MVX線照射裸鼠瘤組織，監(jiān)測(cè)瘤體積，測(cè)量瘤質(zhì)量，取瘤組織行RTPCR、algrooranimalmodelicelydividedintocontrol,radiotherapyandgeneradiothera

2、pygroups.Theovariancancertissueorvolumeandtumoreasured.RTPCR,munohistochemistryandelectronmicroscopyongthreegroupsintumorvolume(P<0.01).Theinhibitingtumorrateoftheradiotherapyandthegeneradiotherapygroupsorcellapoptosis,necrosisprovetheradiosensitivityofovariancan

3、cer.　　【Keyine2000購(gòu)自Invitrogene公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑購(gòu)自O(shè)mega公司;鼠抗EGFR單克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自賽百盛公司;免疫組化試劑盒及SDSPAGE凝膠購(gòu)自博士德公司;總RNA提取試劑購(gòu)自華舜公司;RTPCR試劑盒購(gòu)自寶生公司。　　1.2方法　　1.2.1靶向EGFR基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則及質(zhì)粒載體pGenesil的多克隆位點(diǎn)特點(diǎn)，選擇EGFR家族同源性基因片段(TGGGGTCGTCAAAGACGTT)為模板，利用美國(guó)Dharmaco

4、n公司siRNA設(shè)計(jì)軟件，獲得靶向EGFR基因序列特異性shRNA的質(zhì)粒載體(pGenesilEGFR)：正義鏈：5′UGGGGUCGUCAAAGACGUU3′;反義鏈：5′ACCCCAGCAGUUU　　CUGCAA3′;以此序列為基礎(chǔ),中間加入CUAUGGACA莖環(huán)序列將其分隔為反向重復(fù)序列，兩端加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，送武漢晶賽生物工程公司合成。　　1.2.2建立卵巢癌移植瘤模型采用常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞種植法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，制成4×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取0.3ml接種于每只BALB/C裸鼠右肩胛皮

5、下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。3m3，a.b.c分別為腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)度、寬度、高度。放療后處死裸鼠，測(cè)量瘤塊質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量)/對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%?！　?.2.4RTPCR檢測(cè)EGFRmRNA的表達(dá)分別取3組瘤組織各40mg，提取總RNA，取定量好的RNA5μl，合成cDNA，再通過(guò)PCR擴(kuò)增，EGFR引物序列：P1(上游)5′AGGAGTGCGTGGAGGAAT3′、P2(下游)5′CTGCCGTCGCTTGATGAG3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為425bp;同時(shí)選取GAPDH作為內(nèi)參照，GADPH

6、引物序列：P1(上游)5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′、P2(下游)5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小約310bp。(PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃30s，60℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)，1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))。目的條帶采用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶的灰度值，以EGFR與GAPDH條帶灰度值的比值作為EGFRmRNA的相對(duì)表達(dá)水平，EGFRmRNA表達(dá)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組EGFRmRNA相對(duì)表達(dá)水平/對(duì)照組EGFRmRNA相對(duì)表達(dá)水平)×100%。　　1.2.5o

7、lCells,2005;9(1):115.　　3TomariY，ZamorePD.Perspective：machinesforRNAi〔J〕.GenesDev,2005;19(5):51729.　　4PaddisonPJ，CandyAA,BemstEinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequencespecificsilencinginmammaliancells〔J〕.GenesDev,2002;16:94858.　　5NielsenJS，JakobsenE，HolundB,eta

8、l.Prognosticsignificanceofp53,Her2,andEGFRoverexpressioninborderlineandepithelialovariancancer〔J〕.IntJGynecol