環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于呼吸道合胞病毒的檢測(cè)

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1、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于呼吸道合胞病毒的檢測(cè)王滔林瑜陳俊揚(yáng)葉禮鳴蔣云林(福建省立醫(yī)院福建省兒科研究室350001)【摘要】目的采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立快速檢測(cè)兒童呼吸道合胞病毒的方法。方法收集福建省立醫(yī)院2011-2012年兒科疑似急性呼吸道感染患兒的呼吸道分泌物標(biāo)木137份，同時(shí)采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兒童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒特異性RNA,分析兩者的靈敏性和特異性。結(jié)果LAMP法在恒溫條件下進(jìn)行，特異性好，其靈敏度和可靠性與熒光定量PCR方法相當(dāng)。結(jié)論LAMP方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，僅需簡(jiǎn)易設(shè)備就能快速、高效、簡(jiǎn)便

2、地對(duì)病原微生物進(jìn)行鑒定，是一種快速檢測(cè)呼吸道合胞病毒的新方法。【關(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)基因檢測(cè)【中圖分類(lèi)號(hào)】R446【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】2095-1752(2014)18-0233-02人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,hRSV)是引起嬰幼兒冬春季下呼吸道感染最常見(jiàn)、最重要的病原體之一［1】。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增［2］(LAMP>技術(shù)具有高效、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。為此木文采用LAMP技術(shù)對(duì)疑似呼吸道感染的患兒鼻咽分泌物中的呼吸道合胞病毒進(jìn)行檢測(cè)，并與熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較，探討其臨床成用價(jià)值

3、。1材料和方法1.1材料：(1)生物試劑：BstDNA聚合酶為新英格蘭biolabs公司產(chǎn)品，PMD19-T載體和MiniBESTViralRNA提取試劑盒購(gòu)自寶生物公司。ScriptMAXTMThermoT7試劑盒由上海碩盟生物科技有限公司提供。LAMP引物由寶生物公司合成。RSV熒光定量PCR試劑盒由達(dá)安基因股份有限公司出品。⑵鼻咽分泌物樣木：收集2011-2012年福建省立醫(yī)院兒科(住院及門(mén)診)疑似急性呼吸道感染患兒的呼吸道分泌物標(biāo)本137份，患兒（年齡30d-14周歲）。鼻咽分泌物標(biāo)本采集按［3】方法取得。1.2方法1.2.1實(shí)吋熒光PCR方法檢測(cè)呼吸道合胞病

4、毒：按照說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。1.2.2LAMP檢測(cè)呼吸道合胞病毒：1.2.2.1引物設(shè)計(jì)：LAMP引物設(shè)計(jì)采用Loopamp公司的LAMPPrimerExplorer軟件，參照文獻(xiàn)［4］根據(jù)呼吸道合胞病毒2個(gè)亞型（A型、B型）基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，包括2條外引物F3、B3，2條內(nèi)引物FIP、BIP和2條環(huán)引物L(fēng)F、LB。引物序列見(jiàn)表1、2。表1LAMP檢測(cè)呼吸道合胞病毒A亞型的引物序列1.2.2.2病毒RNA抽提：按照［3］處理鼻咽分泌物樣,采用MiniBESTViralRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法制備RNA,-80°C保存（含RNA酶抑制劑）。1.2.2.3反轉(zhuǎn)

5、錄反應(yīng):20ul反應(yīng)混合物:4ulMgC12,0.5ulRNase抑制物，4ul5×反應(yīng)緩沖液，2uldNTPs,5.5ulRNaseFreedH2O,lulAMVase，lul隨機(jī)引物和2ulRNA樣品。反應(yīng)混合物于30°C溫育lOmin,置42°C45min，然后99°C沸水浴5min以終止反應(yīng)。1.2.2.4環(huán)介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)擴(kuò)增體系含：l.Oul10mMdNTPs,2.5ul10×反應(yīng)緩沖液，簡(jiǎn)并引物（F和B引物各5pmol,FIP和BIP引物各25pmol），補(bǔ)雙蒸水至23ul。加lul模板DNA后，95°C5min,置

6、冰浴3min，加入lulBstDNA聚合酶。然后，62°C溫育45min,80°C5min以終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取2ul反應(yīng)產(chǎn)物，3%瓊脂糖作常規(guī)EB染色電泳，觀察結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水作為陰性對(duì)照。1.2.2.5標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品的制備及反應(yīng)：分段合成引物F3和B3所覆蓋的呼吸道合胞病毒代表株克隆至PMD19-T載體，并亞克隆到PET-28a（+）載體，用ScriptMAXTMThermoT7TranscriptionKit從載體上轉(zhuǎn)錄RNA,同上述方法進(jìn)行LAMPo2結(jié)果2.1LAMP檢測(cè)呼吸道合胞病毒結(jié)果：137份樣品中38份呼吸

7、道合胞病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性標(biāo)本電泳條帶呈現(xiàn)階梯狀分布，與理論結(jié)果相符合（圖略）。2.2LAMP檢測(cè)與PCR反應(yīng)的敏感性比較：將兩份PCR法呼吸道合胞病毒陽(yáng)性標(biāo)本混合好按1:10梯度稀釋?zhuān)♂尯蟮臉悠酚肦T-PCR和LAMP法平行檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性，結(jié)果無(wú)差異，均在1/105吋，檢測(cè)不出。2.3RT-LAMP檢測(cè)呼吸道合胞病毒的特異性比較：采用LAMP法檢測(cè)我院微生物室所發(fā)現(xiàn)的各種其他病原體陽(yáng)性的呼吸道分泌物標(biāo)本，分析該方法的特異性。所涉及的病原體冇：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、等，沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，顯示本方法具有良好的特