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1、蟾毒靈對(duì)裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用及對(duì)Bcl作者：顧偉，韓克起，蘇永華，黃雪強(qiáng)，凌昌全【摘要】探討蟾毒靈對(duì)裸鼠人肝癌原位移植模型的抗腫瘤作用及對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。方法:建立裸鼠人肝癌原位移植模型，隨機(jī)分為蟾毒靈高（1.5mg/kg）、中（1mg/kg）、低（0.5mg/kg）劑量治療組，阿霉素8mg/kg治療組和模型組。裸鼠人肝癌原位移植模型第25天測(cè)量腫瘤體積，取瘤組織做HE染色觀察腫瘤壞死程度并行電鏡觀察，DNA原位末端標(biāo)記法檢測(cè)凋亡標(biāo)記指數(shù)，免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果:蟾毒靈各劑量組腫瘤體積均較模型組明顯縮?。?/p>
2、P<0.01），生存期較阿霉素治療組及模型組延長(zhǎng)（P<0.05）。電鏡觀察到蟾毒靈各組腫瘤出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡征象，低、中、高劑量治療組的凋亡指數(shù)分別為5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42，明顯高于阿霉素治療組的3.28±0.98（P<0.05或P<0.01）;蟾毒靈各組瘤組織的Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)無(wú)明顯改變。結(jié)論:蟾毒靈對(duì)裸鼠人肝癌原位移植模型有明顯的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。【關(guān)鍵詞】蟾毒靈;肝癌;細(xì)胞凋亡;Bcl-2;Bax;裸小鼠 蟾毒靈（bufalin）是從
3、中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一，分子式為C24H32O4，相對(duì)分子質(zhì)量為386.5。研究表明，蟾毒靈具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用，主要涉及到白血病、前列腺癌、胃癌、肝癌等人類腫瘤，且僅限于體外研究［1～4］。本文旨在探討蟾毒靈對(duì)人肝癌裸鼠原位移植模型的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)及對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響?！ ?材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株BALB/C-nu/nu裸鼠，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCKK（滬）2003-0003，4～5周齡，體質(zhì)量18～20g，雄性，在無(wú)特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞株BEL-7402，由中國(guó)科
4、學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。 1.1.2藥物和試劑蟾毒靈，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;阿霉素（adriamycin，ADM），深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;DNA原位末端標(biāo)記試劑盒，BoehringerMannhEin公司產(chǎn)品;鼠抗人Bcl-2和Bax蛋白單克隆抗體，SantaCruz公司產(chǎn)品。 1.2實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1模型分組及處理參照 Table2LabelindexoftumorcellapoptosisandexpressionsofBcl-2andBaxintumortissues *P<0.05，
5、**P<0.01，vsNS-treatedgroup. 圖3裸鼠原位肝內(nèi)移植瘤Bax蛋白的表達(dá)（SP法，×200）（略） Figure3ExpressionofBaxinorthotopicallytransplantedtumorofhumanhepatocellularcarcinomainnudemice（SPmethod，×200） A:Baxexpressedg/kg［12］，本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)2mg/kg的一次性給藥劑量就可使小鼠發(fā)生一過(guò)性的痙攣性抽搐，但未引起小鼠中毒性死亡。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)主要研究給予1.5mg/kg及以下劑量蟾毒靈時(shí)動(dòng)物
6、體內(nèi)的抗腫瘤作用。人類腫瘤裸鼠原位移植瘤模型是抗癌藥物篩選和機(jī)制研究較為理想的動(dòng)物模型，我們成功建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，在此基礎(chǔ)上觀察蟾毒靈對(duì)裸鼠原位人肝癌移植模型的抗腫瘤效果，結(jié)果表明蟾毒靈按總量15、10和5mg/kg分10d連續(xù)給藥治療裸鼠原位人肝癌移植性模型在瘤體縮小方面具有與阿霉素8mg/kg相同的療效，且在帶瘤生存期的延長(zhǎng)及模型生活質(zhì)量（體質(zhì)量的增減）的改善方面，蟾毒靈各治療組明顯優(yōu)越于阿霉素治療組。提示蟾毒靈在體內(nèi)具有良好的抗肝癌作用。病理學(xué)及TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中劑量蟾毒靈不僅能導(dǎo)致肝癌組織中、重度壞死及大量纖維結(jié)締組織增生，而且能原
7、位誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，凋亡標(biāo)記指數(shù)與蟾毒靈給藥呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的基因，目前已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)與Bcl-2同源的基因，包括Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bak、mcl-1、A1、Bag-1、Bfl-1、ced9、BHRF-1等，構(gòu)成了Bcl-2家族。其中Bax基因是Bcl-2家族中的一員，其生物學(xué)作用是拮抗Bcl-2，與Bcl-2形成二聚體，抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài):Bcl-2表達(dá)水平高于Bax時(shí)，Bcl-
8、2和Bcl
